犬细小病毒层析纯化方法的建立

代昕宇，胡博，邓效禹，张成琪，李昀真，李甜甜，孙亚杰，许丽文，白雪

(中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112)

犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科、细小病毒亚科的原细小病毒属。细小病毒科由具有4～6 kb线性基因组的无囊膜单链DNA病毒组成，直径18～26 nm，可感染多种动物[1]。原细小病毒属包括猫细小病毒(feline parvovirus，FPV)、CPV、水貂肠炎病毒(mink parvovirus，MEV)和浣熊细小病毒(rabbacon parvovirus，RPV)[2]。CPV于20世纪70年代末从一种类似FPV的原始病毒中出现，可能是通过物种间跳跃获得了感染家养犬的能力[3]。CPV的线性单链DNA(ssDNA)基因组全长约5 kb，具有2个开放阅读框(ORF)，编码2个非结构蛋白(NS1和NS2)和2个形成病毒衣壳的结构蛋白(VP1和VP2)[4]。

CPV感染是引起犬死亡的主要原因之一，潜伏期3～7 d，发病犬出现严重的肠胃炎、嗜睡、呕吐、发热等症状，病程中肠道组织中广泛自溶，肠道固有层塌缩，隐窝数量减少，可见的隐窝中增生性细胞发生大量堆积[5-7]。CPV对未接种疫苗幼犬的感染率和致死率都很高，可能会在卫生条件较差或未接种疫苗的犬舍暴发大规模的疫情[4]。

病毒纯化是制备高质量抗体或更高安全性疫苗的必要条件。常规的实验室纯化病毒方法包括差速离心、蔗糖密度梯度离心、大分子沉淀和层析纯化等。蔗糖密度梯度离心的方法通常在实验室中采用，纯化少量细小病毒或病毒样颗粒[8-9]，但该方法所用仪器昂贵，基本无法进行扩大生产。层析方法对病毒粒子损伤较小，操作简便，并且能够实现大量制备，已应用于多种病毒和病毒样颗粒的纯化，以去除生物制品中的病毒污染物[10]。本试验建立了一种用于纯化CPV的层析方法，为犬细小病毒病的疫苗、诊断及治疗制品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和耗材

MEM培养基购于Gibco公司，FBS购自上海牛耳生物科技有限公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG购自 BBI生命科学有限公司；抗CPV VP2鼠源单克隆抗体由本团队制备并保存。0.22 μm滤膜和超滤管购自默克-密理博公司；超滤膜包购自Sartorius公司；犬细小病毒检测试纸购自快灵生物有限公司。Sepharose 4 Fast Flow(Sepharose 4FF)填料及层析柱购自博格隆(上海)生物技术有限公司；Purose shell V15填料购自嘉兴千纯生物有限公司。

1.2 细胞培养和病毒增殖

CPV-ZCS株、F81细胞均由本实验室保存。在37 ℃，5% CO2环境下，使用含8% FBS的血清培养F81细胞至长满单层，传代后按照感染比(MOI)为0.1接种CPV-ZCS，继续培养至90%细胞发生病变后收获病毒，反复冻融3次以裂解细胞，收取病毒液。

1.3 病毒初步澄清和浓缩

将病毒液5 000 r/min 离心30 min以初步澄清后，通过50 kDa膜包超滤系统对回收的病毒液进行25倍浓缩并进一步去除病毒液中的细胞碎片。

1.4 病毒的层析纯化

以浓缩后的病毒液作为样品，上样量5 mL，使用AKTA蛋白层析系统分别在Sepharose 4FF填料和Purose shell V15填料中进行层析纯化，缓冲液为20 mmol/L PBS溶液，在1 mL/min的流速下收取紫外光(UV)280 nm监测图谱中出现洗脱峰中的每1 mL流穿液，以细小病毒病原检测试纸初步判断病毒所在UV峰，并用血凝试验进一步确定，-80 ℃冻存备用。

1.5 纯化后病毒的超滤管浓缩

将病毒峰的流穿液合并成一管后加入30 kDa超滤管中，5 000 r/min离心30 min，取超滤管中未透过滤膜的液体，-80 ℃冻存。

1.6 纯化后产物的SDS-PAGE及Western blot检测

取纯化后UV值最高的病毒液1 mL，以CPV病毒液作为阳性对照，F81细胞总蛋白作为阴性对照，以1% BSA作为牛血清相关蛋白对照，将各样品上样于10% SDS-PAGE进行分离后，使用考马斯亮蓝染色液进行染色，观察样品中的蛋白条带；另取凝胶分离后的样品，通过半干式转膜将凝胶上的蛋白条带转移至0.45 μm的硝酸纤维(NC)膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，PBST清洗3次，每次5 min，加入1∶2 000稀释后的CPV VP2单抗作为一抗孵育2 h，PBST清洗3次，加入 1∶10 000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠IgG孵育1 h，PBST清洗3次，最后使用DAB显色试剂盒进行染色并观察NC膜上的蛋白条带。

1.7 总蛋白去除率和病毒回收率测定

用BCA法测定层析前后的蛋白含量，计算出总蛋白去除率。将CPV VP2单抗作为包被抗体，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为酶标二抗，以ELISA双抗体夹心法检测病毒液和纯化样品中的病毒含量，计算病毒回收率。

1.8 电镜观察

采用常规负染法对纯化后的病毒液进行染色，日立(日本)H8100透射电子显微镜观察。

1.9 病毒的血凝性检测

采用血凝试验对不同纯化步骤的病毒进行血凝价的检测，血凝方法参考文献[11]，在96孔V型血凝板上，每孔加入25 μL pH=7.2 的PBS溶液，向第1排分别加入25 μL病毒液、浓缩后的病毒与纯化后的细小病毒，每组2个重复，进行2倍倍比稀释，加入1%的仔猪血红细胞，混匀后4 ℃孵育1 h，将96孔板立起观察结果。

2 结果

2.1 层析图谱分析

澄清及浓缩后的病毒层析图谱见图1，使用快速试纸条检测发现，Sepharose 4FF流穿液中，流穿峰2为唯一含有病毒的峰；而在Purose shell V15中，流穿峰1是唯一检测出病毒的峰。经血凝试验进一步确定(见表1)，发现Sepharose 4FF流穿峰3和Purose shell V15流穿峰2中存在少量病毒。

表1 各取样点血凝效价检测 log2

图1 Sepharose 4FF(A)和Purose shell V15(B)层析图谱

2.2 纯化后病毒液总蛋白去除率和病毒回收率

由表2可知，2种层析填料的总蛋白去除率均在97%以上，但Purose shell V15更高，可达99%以上。ELISA试验结果显示Purose shell V15填料纯化后的病毒回收率更高，达到81.43%。

表2 2种层析柱纯化后的病毒液总蛋白去除率和病毒回收率

2.3 SDS-PAGE和Western blot检测

细小病毒含有3种结构蛋白，VP1(84 kDa)，VP2(67 kDa)和VP3(63 kDa)，其中VP3由VP2通过宿主蛋白酶裂解产生[12]。经层析纯化后，选取抗原试纸测定含有病毒的UV峰，取最高峰的1 mL样品进行SDS-PAGE和Western blot检测。由图2可见，Purose shell V15纯化后可见VP1与VP2蛋白条带，Sepharose 4FF纯化后仅可见VP2条带，且含有部分牛血清蛋白。由图3可见，两种层析填料纯化样品均可见Western blot目标条带，但 Purose shell V15纯化后目标条带更明显。

M. 蛋白质分子质量标准(100 kDa)；1. 阴性对照(F81细胞蛋白)；2. 阳性对照(CPV病毒液)；3. Sepharose 4FF纯化样品；4. Purose shell V15纯化样品；5. 1% BSA对照。

2.4 电镜检测

电镜下观察病毒，结果如图4所示，完整的病毒粒子大小约20 nm，呈二十面体结构。

图4 Purose shell V15(A)和Sepharose 4FF(B)纯化样品电镜检测结果

2.5 血凝试验

对各步骤所得样品进行血凝试验，观察孵育后完全凝集的孔数，确定血凝效价。结果如表3所示，使用2种层析填料纯化后血凝效价稍有降低，超滤管浓缩后血凝效价明显增加，病毒液浓度上升。

表3 血凝试验结果(血凝效价) log2

3 讨论

层析纯化作为一种常用的病毒粒子纯化方法，与离心方法相比有着上样量大、易于放大的优点，并且更容易保持病毒粒子的抗原性[13]，因此在工业上大规模应用于灭活疫苗的纯化制备。本试验采用2种不同填料的层析柱，通过层析将浓缩后的病毒液中各个组分分开后，用SDS-PAGE和Western blot确定了适合于细小病毒纯化的层析柱类型、基本过程参数和病毒主要所在的UV峰，最后使用电镜确定了纯化后病毒的形态。

层析柱上样时对于病毒液的澄清度和浓度都有一定的要求，本试验采用离心和切向流过滤的方式进行病毒上样前的预处理。低速离心(5 000 r/min)可以去除病毒液中的大部分固体颗粒，有助于减小病毒在切向流过滤中受到的剪切力。膜包切向流过滤是一种通过可选孔径(30～300 kDa)的吸附性薄膜分离组分的技术，广泛应用于生物制品的下游纯化工艺中[14]。本试验中根据细小病毒粒子大小，选用50 kDa膜包通过切向流过滤分离病毒与病毒液中的其他液体组分，达到提高留存液中病毒浓度的效果。另外，在层析试验过程中，发现由于细小病毒体积与分子量较小，分子筛填料无法将细小病毒与大部分杂质分离，而带有离子配基的Purose shell V15填料能够将病毒分离在体积很小的UV峰中，对于细小病毒的分离更有优势。

综上，本试验建立的层析纯化方法能够得到高纯度的CPV粒子，具有较好的总蛋白去除率和病毒回收率，为抗体筛选和疫苗制备提供了良好的原材料，为后续进一步的研究奠定了基础。