甘肃玉米灰斑病病原鉴定及遗传多样性分析

戴子淙 高建昊 张小杰 洪流 王春明 周天旺 陈杰新 郭成

摘 要 为掌握甘肃地区玉米灰斑病的发生分布、病原种类及遗传多样性，于2021-2022年调查了该病害在甘肃的分布范围，对采集的灰斑病样品进行分离与鉴定，并采用ISSR分子标记技术对甘肃玉米灰斑病菌的遗传多样性进行分析。结果表明，玉米灰斑病在甘肃陇南和陇东大部分地区均有发生，并已扩展至陇中地区；经形态学和分子生物学鉴定甘肃地区玉米灰斑病病原菌为玉米尾孢（Cercospora zeina）；16条ISSR引物共扩增出74条条带，多态性条带73条，比例为98.65%。甘肃省陇南地区种群遗传多样性最为丰富，且与陕西省的遗传距离最小（0.021 4）、遗传相似度最高（0.978 9），陇东地区次之。在遗传相似系数为  0.63时，可以将所有菌株分为4个亚群，亚群1中有28个菌株，其中包括16株陇南地区菌株、5株陇东地区菌株和7株来自陕西地区的菌株；亚群2中只有1个陇南地区菌株；亚群3中有10个菌株，包括陇南地區4个、陇东地区1个和5个陕西菌株；亚群4有2个菌株，陇东地区和陕西菌株各1个，4大类群分别包含来自不同地域的菌株。以上结果说明，同陇东地区相比，陇南地区与陕西地区的菌株遗传相似度更高，且亚群内遗传多样性与地理来源之间无明显的相关性。

关键词 甘肃；玉米灰斑病；分布；玉米尾孢；遗传多样性

玉米（Zea mays L.）是中国种植面积最大、总产量最高的粮食作物，还是优良的饲料作物和化工原料，在国民经济中占据主导地位［1］。玉米灰斑病是由尾孢属真菌引起的一种世界性玉米病害［2］，主要危害植株叶片，同时也侵染玉米苞叶和叶鞘［3］。严重时病斑汇合连片使叶片枯死，从而影响玉米灌浆，造成籽粒干瘪、千粒质量下降。通常会造成玉米产量损失10%～30%，严重时可达60%以上，甚至造成绝收［4］。由于全球气候变化异常，栽培措施不断变革，玉米品种引种频繁，如今该病害成为中国近年来上升很快、为害较严重的病害之一［5］，已在全国至少17省（自治区、直辖市）87个地市（自治州）发生［6］，严重威胁中国玉米的产量和质量。

目前，全球已知玉米灰斑病的致病菌有4种：玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）、玉米尾孢（C.zeina）、高粱尾孢玉米变种（C. sorghi var. maydis），还有1个未确定种（Cercospora sp.）［7-8］。中国玉米灰斑病的致病菌主要有玉米尾孢和玉蜀黍尾孢，二者在形态上极为相似，在侵袭力和毒力方面未表现出显著不同，但在生长特性、生态适应性和分子特征方面存在差异［9］。北方以玉蜀黍尾孢菌为主，南方则以玉米尾孢菌为主。玉蜀黍尾孢灰斑病最早于1991年在中国辽宁发现［3］，之后迅速蔓延到吉林、黑龙江［10］以及内蒙古自治区，目前已扩展至山西、山东、北京、天津、安徽等9个省［6］。玉米尾孢菌则最早于2001年出现在中国云南地区［9］，2003年在云南西南部爆发，很快成为云南高海拔山区的玉米主要病害，在季风、气候等因素影响下逐年向北扩散至贵州、重庆、四川等地，并迅速取代玉蜀黍尾孢成为西南地区灰斑病的主要致病菌［11］，并有向北方玉米区扩展的态势。已有报道在河北、河南、陕西、四川、湖南和湖北等地均检出两种玉米灰斑病病原［9，12］。

甘肃省是中国北方春播玉米的主产区之一［13］，玉米种植区域主要集中在河西走廊、陇东地区、甘肃中部及陇南山地［14］。近几年甘肃省农业科学院植物保护研究所玉米与杂粮作物病害研究室

对甘肃玉米灰斑病发生重点区域及周边地区进行监测，发现该病害已经由陇东、陇南地区扩展至甘肃中部，且有扩散趋势。目前中国对于玉米灰斑病病原学和发生流行规律的研究与报道有很多，但尚未见有关甘肃地区玉米灰斑病的系统性研究。因此，摸清甘肃地区玉米灰斑病的发生分布、病原种类及种群的遗传变异情况，以便进一步监测预警该病害的发生流行，同时为该病害的综合治理提供技术支撑，这对保障甘肃乃至西北地区玉米产业的绿色发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病害调查和样品采集

甘肃省农业科学院植物保护研究所玉米与杂粮作物病害研究室

于2021-2022年对甘肃省陇南、陇东和中部地区进行调查并采集样品，玉米灰斑病调查参照中华人民共和国农业行业标准，NY/T1248.11-2016“玉米抗病虫性鉴定技术规范-第11部分：灰斑病”［15］。调查地点涉及甘肃7个市46个县镇，共采集样品60份。

1.2 供试材料

供试培养基：水琼脂培养基（WA）成分为琼脂15 g、水1 L；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）成分为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水  1 L；玉米叶粉碳酸钙琼脂培养基（MLPCA）成分为玉米叶粉15 g、CaCO3 3 g、琼脂15 g、水1  L［16］。

试剂及仪器：2×Power Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker均购自近岸蛋白质科技有限公司；TBE购自北京索莱宝科技有限公司；真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒（B518229-0100）购自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 病原菌的分离纯化

参考谭世麒［5］的方法进行分离。病健交界处剪取5 mm×5 mm左右组织块，无菌水冲洗表面，使用75%酒精浸洗约30 s，无菌水漂洗3次。将处理好的叶片平铺在叠有湿润滤纸的WA上，25 ℃培养5～10 d。待生长出菌丝后挑取至PDA上培养。单孢纯化采用方中达［17］的方法并加以改进。将分离物在PDA上25 ℃恒温黑暗培养15～20 d后，刮取菌丝于试管内，加入3～5 mL的无菌水震荡，制成孢子悬浮液均匀涂布至WA上（每10 μL孢子悬浮液在10倍镜下观察每个视野有1～2个孢子即可）。利用体式显微镜挑取单个孢子至PDA培养基，25 ℃培养5～10 d，即可获得纯化菌株。

1.4 形態学鉴定

参考刘可杰等［18］的方法，将纯化菌株转接于PDA和MLPCA上培养。PDA培养基置于  25 ℃黑暗培养30 d，观察并记录菌落的形态特征、生长直径等状况；MLPCA培养基置于25 ℃培养箱中黑暗培养5～7 d。利用接种针轻刮菌落表面制成简易玻片，观察菌丝及分生孢子梗的形态特征，测量40～50个分生孢子大小，求取平  均值。

1.5 分子生物学鉴定

纯化菌株在PDA上培养30 d左右刮取菌丝，待干燥后装入无菌离心管，经液氮充分冷冻后研磨成粉末，用真菌基因组DNA快速抽取试剂盒提取菌株DNA。将玉米灰斑病致病菌H3组蛋白通用引物CylH3F和CyIH3R作为尾孢菌阳性对照对供试菌株进行PCR扩增，通过产物的片段大小判断是否为Cercospora。采用C.zeae-maydis、C.zeina、未知种Cercospora sp.的特异性引物组合CzeaeHIST/CyIH3R、CzeinaHIST/CyIH3R、CmaizeHIST/CyIH3R对全部菌株进行尾孢菌种的特异性检测，明确病原种类。在此基础上，采用对尾孢属不同种具有多态性扩增的引物CZM2F/CZM2R进一步鉴别C.zeae-maydis、C.zeina和C. sorghi var. maydis（高粱尾孢玉米变种），引物序列见表1。参考赵立萍［19］的PCR反应体系：DNA模板2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 补足25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环，72 ℃最终延伸  10 min。取5.0 μL PCR产物在1.0 %的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检验基因扩增结果。

将PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行H3组蛋白基因测序，测序结果在NCBI网站上进行比对，并从GenBank数据库下载同源性较高的H3组蛋白基因序列，利用MEGA7.0软件采用邻近相接法构建系统发育树（Bootstrap=1 000）。

1.6 ISSR遗传多样性分析

参考张小飞等［20］、赵立萍［19］和陈思文［21］筛选的多态性丰富的16条ISSR引物（表2），对28株甘肃菌株进行ISSR扩增，并选择13株陕西菌株作为参照（表3）。ISSR反应体系同“1.5”节，反应程序参考赵立萍ISSR-PCR扩增所用程序。取5.0 μL PCR产物在1.0 %的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用凝胶成像系统拍照并用Excel 2019统计条带数（同一位置有条带记为1，无条带记为0）。利用Popgen 32软件和NTSYS-pc2.10 version软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 玉米灰斑病分布地域

2021-2022年对甘肃省陇南、陇东、中部地区共计46个乡镇进行实地调查，发现玉米灰斑病在陇南市成县、康县、徽县和两当县发生严重，其中徽县的柳林镇、银杏树镇和栗川镇部分田块灰斑病病株率达到100%，病级3～5级；徽县伏家镇病株率100%，病级为1～3级；成县红川镇、抛沙镇病株率达到100%，病级5～7级；两当县城关镇、金洞乡病株率分别为100%和50%，病级均为1～3级，属偏重发生。天水市的秦州区、秦安县、麦积区和陇南市的礼县、西和县灰斑病的平均病株率为8.2%～16.7%，属中度发生。平凉市的泾川县、崇信县、华亭县、崆峒区；庆阳市的合水县、环县、镇原县、西峰区；陇南市的武都区和宕昌县灰斑病的平均病株率小于5%，属轻度发生。甘肃中部兰州市榆中县、白银市会宁县和定西市安定区该病害零星发生。病害分布区域见图1。

2.2 形态学鉴定结果

病菌在PDA培养基上生长缓慢，菌落致密，近圆形，边缘呈平滑或不规则状，菌落正面灰白至灰黑色，背面铁灰色，偶有十字状开裂，1～2周后菌落表面萌发出白色絮状菌丝，培养20 d菌落直径为7～14  mm，生长速率为0.5～0.65 mm/d。光学显微镜下观察，分离菌株的分生孢子梗呈淡橄榄色或棕褐色，有1～5个隔膜，一般3～14根簇生，直或膝状弯曲；分生孢子单生，呈半透明状，为倒棍棒状或纺锤形，薄壁，光滑，顶端微钝，有  1～10个隔膜，大小在（42.4～100.5）μm×  （4.5～10.8）μm，平均为65.6 μm×7.6 μm。同赵立萍等［9］、刘庆奎等［10］报道的形态学特征一致。形态学鉴定表明，分离菌株均为玉米尾孢（C.zeina）。菌落及孢子形态见图2。

2.3 分子生物学鉴定结果

利用H3组蛋白通用引物CylH3F和CyIH3R作为尾孢属真菌阳性对照对供试菌株进行PCR扩增，扩增出目的片段大小均为389 bp（图3），可初步确定供试菌株均为Cercospora。采用4对特异性引物进行PCR扩增，仅C.zeina的特异组合CzeinaHIST和CyIH3R扩增出284 bp的目标片段，C.zeae-maydis和未知种Cercospora sp.的特异引物组合并未扩增出条带。以CZM2F和CZM2R的引物组合扩增仅获得310 bp的C.zeina特征条带（图4），未扩增出代表C.zeae-maydis（760 bp）和C.sorghi var.maydis  （1 020 bp）的条带。

将PCR产物测序结果上传至NCBI基因库进行比对，结果表明：28株菌株同玉米尾孢（C.zeina）序列同源性最高。利用MEGA7.0软件以玉米大斑凸脐孺孢菌（Exserohilum turcicum）为外类群，玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）为内类群构建系统发育树（Bootstrap=1 000），结果显示供试的28株菌株均能与玉米尾孢（C.zeina）聚为一支（图5）。通过对两种鉴定结果进行分析比较认为，分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致，此次分离出的28株菌株均为玉米尾孢  （C.zeina）。

2.4 ISSR遗传多样性分析

对供试的41株玉米灰斑病菌（甘肃28株，陕西13株）进行ISSR扩增，结果表明：扩增条带的分子碱基数为100～2 000 bp（图6），16条ISSR引物共扩增出74条条带，平均每条引物扩增出4.63条条带，其中多态性的条带数为73条，多态性条带比例为98.65%，不同引物扩增出的遗传图谱差异较大，同一引物下不同菌株的条带相似但不完全一致，这表明玉米灰斑病菌群体有丰富的遗传多样性。将建立的0、1矩阵，利用Popgen软件分析，结果显示（表4），Neis基因多样性指数和Shannon信息指数均以陇南地区为最高，分别为0.311 5和0.464 9，该地区菌株的基因丰富度最高；陕西省次之，分别为0.294 3和0.448 0，陇东地区分别为0.265 3和0.397 0；3个地区的有效等位基因数在1.452 1～1.541 5，平均有效等位基因数为1.493 6；多态位点百分率在  74.32～91.89，平均为85.58；多态位点数在55～68，平均为63.33。陇南地区有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannon信息指数、多态性位点数和多态位点百分率最高，表明陇南地区菌株遗传多样性最为丰富。

如表5所示，甘肃2个地区中陇南地区与陕西省的遗传距离最小（为0.021 4），遗传相似度最高（为0.978 9）；陇东地区与陕西省的遗传距离最远（为0.048 7），遗传相似度最低（为0.952 4）；而陇东地区与陇南地区的遗传距离为0.037 3，遗传相似度为0.963 3，介于二者之间；表明这3个地区间病原菌的遗传相关性较高且不同地区种群间的遗传分化程度有差异，甘肃陇南地区与陕西省玉米灰斑病病原之间遗传距离小，亲缘关系更近。

利用NTSYS-pc version 2.10软件对供试的41个菌株进行聚类分析。结果显示（图7），供试菌株间的相似系数为0.59～0.92，不同菌株间相似程度有显著差异。遗传相似系数为0.63时，可以将所有菌株分为4个亚群，亚群1中有28个菌株，其中包括16株陇南地区菌株、5株陇东地区菌株和7株来自陕西地区的菌株；亚群2中只有1个陇南地区菌株；亚群3中有10个菌株，包括陇南地区4个、陇东地区1个和5个陕西菌株；亚群4有2个菌株，陇东地区和陕西菌株各1个。4大类群分别包含来自不同地域的菌株，结果说明亚群内遗传多样性与地理来源之间无明显相关性。

3 结论与讨论

为明确近期玉米灰斑病在甘肃省的发病情况，甘肃省农业科学院植物保护研究所玉米与杂粮作物病害研究室于2021-2022年对甘肃省玉米种植区进行调查，结果显示甘肃7个市（州）46个乡镇玉米灰斑病均有发生和危害，其中陇南市的徽县、成县和康县等部分地区发病最重，天水市、平凉市及庆阳市发病较轻，甘肃中部的兰州市榆中县、白银市会宁县和定西市安定区也有零星发生。对比郭成等［22］2015年仅在甘肃陇南地区发现玉米灰斑病的结果，该病害已扩展至甘肃陇东地区和陇中地区，发病地区数量呈明显增加趋势。如今玉米灰斑病已成为甘肃玉米生产的潜在危害之一，应警惕该病害进一步向甘肃其他地区继续扩散的可能。

本试验对甘肃玉米灰斑病标样进行分离，经形态学和分子生物学方法将其病原菌确定为玉米尾孢（C. zeina）。与玉蜀黍尾孢相比较，玉米尾孢具有更强的致病力，且与寄主的适合度更高［19］。高海拔高湿度的环境条件更加适宜尾孢灰斑病的发生和流行［23］。目前由玉米尾孢菌引起高度感染的地区，如云南海拔1  200～2 100 m的山区，四川省海拔1 000 m以上的地区等，均位于海拔较高的玉米种植区。甘肃省海拔1 500～  3 000 m，且陇南地处秦巴山地，雨量丰沛、气候冷凉湿润，适宜尾孢灰斑病生存，这与该地区发病较重的调查结果相一致。作为一种气传病害，玉米灰斑病的病原可随气流远距离传播。有研究表明尾孢菌正以云南为中心沿着贵州、四川、湖南、湖北、陕西和河南一线向中国黄淮海夏玉米区及北方春玉米区扩散［6］。但甘肃省农业科学院植物保护研究所玉米与杂粮作物病害研究室在与甘肃接壤的四川省广元市一带并未调查到该病害的发生分布，同时甘肃与四川省接壤的陇南市文县该病害仅为零星发生，而同陕西省相接的陇南市康县、成县、两当县等地发病较重，因此推断病原菌可能借助由太平洋暖湿气流带来的东南向西北的水汽输送从陕西传至甘肃。为进一步探究陕西与甘肃病原之间的潜在联系，本研究对甘肃省陇南、陇东及陕西省的玉米灰斑病菌株进行ISSR遗传多样性分析，结果显示多态性条带比例为98.65%，这表明玉米灰斑病菌群体有丰富的遗传多样性。这与张小飞等［12］、任智惠等［24］研究得出玉米灰斑病菌菌株间具有丰富的遗传多样性的结论一致。Popgen分析结果显示Neis基因多样性指数在  0.265 3～0.311 5，Shannon信息指数在0.397 0～ 0.464 9，表明甘肃玉米尾孢菌种群存在较高的遗传变异，这与赵立萍［19］研究发现玉米尾孢种群存在较高的遗传变异这一结论相一致，但与刘庆奎［23］研究认为在玉米灰斑病菌中存在的遗传变异不高的结论不一致。这可能是各地不同地区的病原菌受气候、人工作业等诸多因素对遗传变异的影响表现出差异导致的。其中陇南地区和陕西省的遗传相似度高达0.978 9，陇东地区和陕西省的遗传相似度高达0.952 4，说明甘肃省玉米灰斑病菌与陕西省玉米灰斑病菌的亲缘关系较近，这与赵立萍［19］、Duan等［25］关于陕西和甘肃玉米灰斑病菌种群遗传相似度高的结论一致，说明这两个地理种群之间存在密切的遗传交流。当遗传相似系数为0.63时，可以将所有菌株分为4个亚群，4个亚群分别包含来自不同地域的菌株，结果说明亚群内遗传多样性与地理来源之间无明显的相关性，这与张小飞等［20］、任智惠等［24］研究结论一致。玉米尾孢菌从陕西西部与甘肃接壤的汉中、宝鸡、咸阳一带随风雨进入陇南及陇东地区，并逐年向中部扩展。因此，需警惕未来数年该病害有可能通过甘肃陇东地区进入宁夏南部和陕西北部等地，以防对玉米生产造成威脅。

本研究初步明确了玉米灰斑病在甘肃省的地域分布、病原种类以及病原菌遗传多样性，仍需开展病害监测预警和发生规律等方面的相关研究，旨在为该病害的综合防控提供技术支撑。

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Identification and Genetic Diversity Analysis of Pathogen of Maize Gray Leaf Spot in Gansu

Abstract In order to understand the occurrence and distribution of maize gray leaf spot and its pathogen species and genetic diversity  in Gansu Province，the distribution range of the disease in Gansu Province was investigated during 2021 to 2022. The  samples of gray leaf spot were isolated and identified，and the genetic diversity of the pathogen was analyzed by ISSR molecular marker technology. The results showed that the gray leaf spot occurred in most areas of eastern and southern Gansu，and  extended to central Gansu. The pathogen of gray leaf spot was identified as Cercospora zeina by morphology and molecular biology. A total of 74 bands were amplified by 16 ISSR primers，with 73 polymorphic bands，accounting for 98.65%. The genetic diversity of Longnan population was the most   abundant，and the minimum genetic distance from Shaanxi Province was 0.021 4，and the highest genetic similarity was 0.978 9，followed by Longdong region. When the genetic similarity coefficient was   0.63，all strains could be divided into four subgroups. There were 28 strains in subgroup 1，including 16 strains from Longnan，five strains from East Gansu and seven strains from Shaanxi. There was only one strain from Longnan in subgroup 2. There were 10 strains in subgroup 3，including four strains from Longnan，one strain from East Gansu and five strain from Shaanxi. There were two strains in subgroup 4，one strain from Shaanxi， and one strain from Longdong. The four groups contained strains from different regions. The above results showed that compared with East Gansu area，the genetic similarity of strains from Longnan and Shaanxi was higher，and there was no significant correlation between genetic diversity and geographical origin.

Key words Gansu Province; Gray leaf spot; Distribution; Cercospora zeina; Genetic diversity