舒心解郁颗粒制备工艺及关键成分含量测定研究

谢先娇，彭进城，左池靖，张 静，梁万徽，汪 杰，訾苗苗，韩 双，方 玲，彭 灿，4，5，6，7，8

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.安徽中医药大学附属太和中医院，安徽 太和236600；3.安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥230022；4.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥230012；5.安徽省乡村振兴协同技术服务中心，安徽 合肥230012；6.安徽省现代中药产业共性技术研究中心，安徽 合肥230012；7.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥230012；8.安徽省中医药研究院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥230012）

舒心解郁颗粒由柴胡、赤芍、白芍、当归、川芎、郁金、酸枣仁、炙甘草、夜交藤、柏子仁、远志、菊花、石菖蒲、合欢皮、川楝子、延胡索十六味中药提取制备而成，原方为舒心解郁汤，来源于安徽省太和县中医院的临床经验方，且临床疗效明确［1］。2020 版《中国药典》中规定含量测定成分：赤芍和白芍为芍药苷，当归为阿魏酸。研究报道，芍药苷对产后抑郁大鼠、中风后抑郁大鼠、重度抑郁大鼠和血虚肝郁大鼠等均有改善作用［2-5］。当归等传统中药材中均富含阿魏酸，Dong 等［6］梳理一系列机制，体内外实验表明阿魏酸抗抑郁作用。菊花中绿原酸和3， 5-O-双咖啡酰基奎宁酸有效成含分量高［7，8］，已有研究表明，采用绿原酸预处理促肾上腺皮质激素诱导重度抑郁症模型的大鼠，可以显著改善大鼠抑郁样行为、血清生化水平和肠道微生物群落结构，从而发挥抗抑郁作用［9］。斯皮诺素是酸枣仁的重要成分，可通过GABA 和5-HT 系统起到治疗焦虑作用［10］。绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量较高，稳定，均可以测定，且能达到本方疏肝理气、宽胸止痛、安神的疗效，是治疗疾病伴随抑郁的常见药物成分。在实验过程，洋川芎内酯Ⅰ和没食子酸的含量稳定且较高，且洋川芎内酯Ⅰ是舒心解郁方中当归和川芎重要成分，可以有效防治抑郁症和偏头痛，更好地发挥疗效。因此，没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和洋川芎内酯Ⅰ，可能是该制剂发挥药效的关键成分。

目前临床多以汤剂使用，但因煎煮困难、服用量大、贮存困难、中药味浓、患者顺应性差等不足，难以满足临床应用需求［11］。为此，开发成更适用于临床的药物制剂迫在眉睫。颗粒剂是在汤剂的基础上，进一步浓缩、干燥、添加辅料等系列过程制备而成［12］，具有易吸收、剂量准确、使用方便等特点。为最大限度保留方中各味药材的有效成分，保证颗粒剂疗效，我们遵循中药汤剂的传统煎煮方法，将原药材按照配比，以用水煎煮的方式进行提取［13］。并以中药复方常用评价指标出膏率对煎煮次数、煎煮时间、药辅比进行考察，同时正交实验优选最佳煎煮工艺参数［14，15］。然后对浓缩干燥后的物质进行成型工艺研究，为舒心解郁颗粒的研发制备奠定基础。

另一方面，中药复方制剂化学成分较复杂，多成分、多靶点协同作用是其发挥作用的重要特征［16］。且舒心解郁颗粒临床使用量较大，质量评价标准尚未完全确定，为更好地控制舒心解郁颗粒临床应用的安全性，展现中药复方制剂多靶点、多成分的应用特点，及发展院内制剂，确保其质量可控，本实验对其制备工艺进行优选，并拟建立关键物质含量测定方法。以期为舒心解郁颗粒的进一步规模化生产和市场化提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters 2489 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），DF-101S 型恒温水浴锅（上海越众仪器设备有限公司），YL-060S 型超声波清洗机（中国济南巴克超声波科技有限公司），AB135-S 型十万分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.2 材料

纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），无水乙醇（分析纯）购自合肥宝添科贸有限公司，甲醇（色谱纯）购自上海安耐吉科技有限公司、乙腈（质谱级）购买于Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；甲酸（分析纯，山东禹王实业有限公司），对照品：没食子酸（PU0918-0025）、绿原酸（PU0100-0025）、芍药苷（批号PS000825）、斯皮诺素（批号PS15260100）、阿魏酸（批号PU07720050）、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号PU0680-0025）和洋川芎内酯Ⅰ（批号PS21690020）对照品（纯度均≥98.0%），均购于成都普思生物科技有限公司，药材：当归、炙甘草、延胡索、郁金和酸枣仁购自安徽金正元中药饮片有限公 司，柴 胡（批 号：22071401）、赤 芍（批 号：22020801）、白芍（批号：21112701）、菊花（批号：22071301）、川芎（批号：22071401）采购于安徽守正中药饮片有限公司，夜交藤（批号：21112701）、柏子仁（批号：21112701）、远志（批号：220901）、石菖蒲（批号：201201）、合欢皮（批号：221001）和川楝子（批号：220501）购于安徽省万生中药饮片有限公司，实验室试制舒心解郁颗粒（批号：230316、230320、230321、230322、230323、230324）。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺

1.3.1.1 药材吸水率 将药材按配比，放入双层滤布中，置入2 000 mL 烧杯中，加入10 倍水，浸泡24 h，将药材表面流动的水滤去，倒尽全部未被吸收的溶剂，然后算出吸水率，吸水率（%）=［加水量（mL）-滤液量（mL）］/药材量（g）×100%［17-19］。

1.3.1.2 出膏率 取舒心解郁方水煎液25 mL，放入干燥的、已恒定重量的蒸发皿，水浴蒸干，105 ℃环境中，干燥3 h，用干燥器冷却30 min，然后，迅速精密称定重量M2［20］。计算出膏率公式为：出膏率=（M2-M1）×V/（M×25）×100%（M1：蒸发皿质量，M2：25 mL 药液中固体物和蒸发皿的质量，V：提取液体积，M：药材投料量质量）［21］。

1.3.2 正交实验及验证 参照文献［14，15］提取工艺因素和考察指标，结合舒心解郁颗粒情况，进行正交试验设计，并对优选后的结果进行验证。见表1。

表1 中药舒心解郁颗粒提取工艺正交实验水平因素表Tab 1 Factor table of the orthogonal experiment levels for the extraction process of Chinese medicine Shu Xin Jie Yu Granules

1.3.3 制剂成型性研究 按1.3.2 优选方法，将滤液浓缩至适当相对密度［（1.15～1.20）（60 ℃）］浸膏，干燥，备用。依次考察辅料种类、润湿剂浓度、辅料用量和干燥温度的最佳水平。其中，考察辅料种类包括可溶性淀粉、糊精和微晶纤维素；润湿剂为乙醇，考察浓度包括60%、70%、80%、90% 和100%的乙醇；最终选择糊精作为辅料，考察药辅比例为1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2.0 和1∶3.0；对于湿颗粒的干燥温度，考察温度为45 ℃、55 ℃、65 ℃和85 ℃。以成型率、休止角、吸湿率为考察指标，筛选最优工艺，3 项指标的权重系数分别为0.4、0.2、0.4。综合评分=（成型率/最大成型率）×0.4+（最小吸湿率/吸湿率）×0.4+（最小休止角/休止角）×0.2［17，22］。

1.3.4 指标成分含量测定

1.3.4.1 色谱条件 East Laboratory Epic C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～30 min， 90%～38%B；30～40 min， 38%～42%B； 40～42 min， 42%～61%B； 42～46 min， 61%～90%B； 46～51 min，90%～10%B； 51～56 min， 10%B），体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长254 nm。

1.3.4.2 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和洋川芎内酯Ⅰ对照品适量置10 mL 容量瓶，加甲醇至刻度，超声至充分溶解，补重，制成质量浓度分别为258、244、495、240、260、366、246 μg/mL 的溶液，过0.22 μm 有机微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。

1.3.4.3 供试品溶液的制备 精密称定舒心解郁颗粒样品2 g，研细，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，25 ℃超声，提取20 min。然后放至室温，补足失重，取上清液，然后用0.22 μm 的有机微孔滤膜进行过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2 结果

2.1 提取工艺研究

2.1.1 中药材浸泡时间考察

2.1.1.1 中药材吸水率考察 按照处方比例取药材约113 g，按照1.3.1 提取工艺中药材吸水率实验计算吸水率。见表2。

表2 药材吸水率考察结果Tab 2 Examination results of the water absorption of herbs

由表1 可知，处方量药材浸泡24 h 后药材平均吸水量为261.01%（RSD=1.72%）。为方便操作，药材吸水量以2.5 倍计。因此第一次加水量多加2.5 倍。

2.1.1.2 浸泡时间对浸膏得率影响 以浸膏得率为指标，以水为溶剂，在满足2.5 倍吸水量条件下，分别考察不同浸泡时间对水提液浸膏得率的影响，优选对水提液浸膏得率影响最大的浸泡时间。见表3。

表3 浸泡时间对浸膏得率影响Tab 3 Effect of soaking time on the yield of extracts

结果显示，2.0 h 后总固体得率不再显著增加，说明已经浸泡基本完全。考虑到若药材浸泡时间过长，可能滋生细菌和引起变质，而不再进一步延长浸渍时间，因此，可以确定饮片提取前的浸泡时间为2.0 h。

2.1.2 正交实验结果 选取提取时间、提取次数和加水量为自变量，作为提取工艺因素水平，以出膏率考察指标进行正交试验设计，建立最优提取工艺，实验结果和分析见表4、5。

表4 中药舒心解郁颗粒提取工艺正交实验结果Tab 4 Results of orthogonal experiments on the extraction process of the Chinese herbal medicine Shu Xin Jie Yu Granules

结合表4 及表5 的分析结果，以浸膏得率作为评价指标，考察提取效果的影响因素顺序为B＞A＞C，最佳提取条件为A3B3C3，考虑到大生产降低成本和缩短生产周期，选择A3B3C2即药材饮片加12 倍量水，煎煮3 次，每次40 min。

表5 方差分析结果Tab 5 Analysis of Variance Results

2.1.3 验证实验 为检验提取工艺的可行性，合理性，根据优选的提取工艺，设计3 批实验，对提取工艺进行验证。按比例称取3 份药材，加12 倍水煎煮，提取3 次，每次40 min，分别测定干浸膏得率，计算综合评分［23］。见表6。

表6 提取工艺验证实验结果Tab 6 Results of the extraction process validation experiments

最终测试得出干浸膏得率的均值数据是22.86%（n=3，RSD=1.11%）。由实验结果可知，本方法准确有效，具备可行性。

2.2 颗粒剂成型工艺研究

2.2.1 辅料种类选择 根据中药颗粒剂制备的特点，舒心解郁浸膏减压干燥耗时长，且所得干浸膏粉有较大黏性和吸湿性，流动性差，直接制粒困难，不易储存，故实际生产中，在湿浸膏中加入一定辅料进行喷雾干燥，缩短干燥时长并改善其物理性质，通常选择以可溶性淀粉、糊精、糖粉和微晶纤维素为辅料。以糊精为辅料时，颗粒容易制备，且优于其余辅料组，经济实用，所以选用糊精为辅料进行后续试验。

2.2.2 润湿剂浓度的筛选 本文采用湿法制颗粒技术，润湿剂选择不同比例的乙醇，以软材达到“轻握成团，轻压即散”为原则，考察乙醇浓度对成型工艺的影响，以软材性状、成型率、制粒难易程度为指标，筛选合适浓度的乙醇作为润湿剂［22］。见表7。

表7 润湿剂浓度考察结果Tab 7 Results of examination of wetting agent concentrations

试验结果表明60%～90%的乙醇所制颗粒剂性状相差不大，但考虑到本方中药材吸湿性，最终选择80%乙醇为润湿剂［24］。

2.2.3 辅料用量 考察不同药辅比，以80%乙醇作润湿剂，进行制粒，整粒，通过对成型率、休止角、溶解时间和吸湿率指标的研究，确定适宜的辅料配比［25］。成型率按照药典双筛分法进行测定，溶化性通过颗粒在热水中的溶解情况进行评价，休止角按照固定圆锥的测定方法进行测定。取适量的糊精，药辅比1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2.0、1∶3.0，按上述方法去制备颗粒，检测制得的样品的成型率等4 项指标和成型率、休止角、吸湿率的综合评分。见表8。

表8 辅料用量考察结果Tab 8 Examination results of excipient dosage

实验结果显示，使用药辅比1∶1.8，制成的颗粒样品综合评分最高，故处方中药辅比为1∶1.8 最佳。

2.2.4 干燥温度 按上述方法制粒，将制得的湿颗粒分成3 份，分别放入45 ℃、55 ℃、65 ℃和85 ℃的烘箱中干燥，观察颗粒的干燥情况，结合考虑节省工时，成分不被高温破坏，最终选择湿颗粒干燥条件为干燥温度65 ℃。

2.2.5 重复性实验 上述实验结果，得出制备颗粒剂最优的方法为：以糊精为辅料，药辅比为1∶1.8，80%乙醇为润湿剂，65 ℃进行干燥，根据实验优选得到最佳提取工艺，进行3 次实验制备颗粒，主观评价所得产品：深棕色，颜色均一，无结块现象，硬度适宜，颗粒大小较均匀［24］。同时对其考察指标进行测定。见表9。

表9 重复性实验结果Tab 9 Repeatability experiment results

2.3 舒心解郁颗粒含量测定

2.3.1 专属性试验 按“1.3.4.1” 项下色谱条件，检测并记录空白试剂、供试品溶液和混合对照品溶液色谱图。对照品和供试品溶液色谱图谱，各峰分离度良好，在各对照品成分的相应位置，供试品中均有色谱峰与之对应，表明该方法专属性较好，可以用来舒心解郁颗粒含量测定，色谱图见图1。

图1 舒心解郁颗粒专属性试验HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Shu Xin Jie Yu Granules exclusive test

2.3.2 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液，逐次按浓度稀释，分别放入10 mL 容量瓶，用甲醇加至刻度，混匀，过0.22 μm 有机微孔滤膜，取续滤液，按照1.3.4.1 项下色谱条件进样分析，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，获得各成分线性关系。见表10。

表10 7 个成分的线性关系考察结果Tab 10 Results of linear relationship examination of seven components

2.3.3 精密度试验 在1.3.4.1 项下色谱条件，连续进样6 次，1.3.4.2 项下混合对照品溶液，记录峰面积，没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ的峰面积RSD 分 别 为 0.77%、0.79%、0.076%、0.75%、0.71%、0.76%、0.74%，表明仪器精密度较好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批舒心解郁颗粒（批号：230316），根据1.3.4.3 项方法配制供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h，按2.1 项下色谱条件进行检测，记录峰面积，没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ的峰面积RSD 分别为1.40%、1.23%、1.52%、1.16%、1.10%、2.50%、0.85%，表明供试品在24 h之内稳定性较好。

2.3.5 重复性试验 取舒心解郁颗粒（批号：230316），按1.3.4.3 项方法，平行配制供试品溶液6份，按1.3.4.1 项下色谱条件进行检测，记录峰面积，没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ的峰面积RSD分 别 为1.63%、1.92%、1.21%、1.02%、1.27%、1.15%、1.16%，表明方法重复性较好。

2.3.6 加样回收试验 精密称取已知含量的舒心解郁颗粒6 份（批号：230316），分别加入相当于样品含量100%对照品各6 份，按1.3.4.3 所述配制供试品溶液，进样并测定，然后计算加样回收率。没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ的平均加样回收率分 别 为 97.64%、103.95%、102.25%、103.89%、102.03%、99.98%、100.77%；加样回收率的RSD 分别为1.10%、1.99%、0.86%、1.79%、1.84%、0.12%和0.97%。

2.4 样品含量测定

取6 批舒心解郁颗粒（批号：230316、230320、230321、230322、230323、230324），进行含量测定，该批样品中，没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ的平 均 含 量 分 别0.193 1、0.130 1、0.618 6、0.077 2、0.378 9、0.107 0、0.059 0 mg/g。见表11。

表11 样品含量测定结果（mg/g）Tab 11 Results of sample content determination（mg/g）

3 讨论

3.1 成型工艺

颗粒剂常使用的辅料为糊精、可溶性淀粉、微晶纤维素、乳糖、糖粉等［26］。考虑到部分患者可能存在乳糖酶缺乏，使用乳糖易造成患者腹泻等不良反应，因此辅料不使用乳糖。而蔗糖容易吸湿，过多摄入引起肥胖和血糖升高等不良反应，辅料不考虑使用糖粉。糊精、可溶性淀粉和微晶纤维素均可制粒，而可溶性淀粉过筛时细粉过多，成型率低于糊精和微晶纤维素，且与微晶纤维素相比，糊精作为辅料的操作性更强，颗粒更均匀，因此选用糊精作为辅料。蒸馏水和乙醇是颗粒剂最常用的润湿剂，而舒心解郁方以浸膏形式制粒，浸膏有较大黏性，因此试验选用80%乙醇进行制粒，结果显示软材黏度适中，并且颗粒成型性好。

3.2 含量测定

对正交实验各工艺提取物均进行指标成分含量测定，在加入12 倍水，提取3 次，每次40 min 的提取工艺条件下，指标成分含量最高，进一步验证优选后的工艺是适用的。舒心解郁颗粒，成分复杂、干扰成分多，难以用HPLC 实现精确定量。后期我们拟运用灵敏度更高、选择性更强、准确性更好的UHPLC-MS/MS 联用，将离子按质荷比分离后进行检测的方法，对舒心解郁颗粒进行含量测定［27］。在前期预实验，我们考察了以乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%甲酸为流动相，结果发现在流动相中选择加入百分之零点一的甲酸，可以获得良好的分离效果，且无拖尾现象，达到最佳的峰形［27］。为确保测定过程舒心解郁颗粒中的没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和洋川芎内酯Ⅰ的成分含量，各组分均有较好的响应值，采用DAD 检测器对舒心解郁颗粒溶液进行全波长扫描，最终选择254 nm 作为检测波长。

本研究采用正交试验优选提取工艺，并对制粒所用辅料和方法进行优化。建立没食子酸、绿原酸、芍药苷、斯皮诺素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和洋川芎内酯Ⅰ的高效液相色谱含量测定方法。所建立的方法，简单易操作，稳定可靠，为后期更好地挖掘舒心解郁颗粒的药效物质基础及质量评价提供依据。

作者贡献度说明：

谢先娇：参与实验选题与设计，进行提取工艺、成型工艺和含量测定试验、指标测定、数据分析和论文撰写；彭灿、韩双：提供基金支持，并对论文提出建设性意见；左池靖、张静、梁万徽、汪杰、方玲：指导、论文修改；彭进城、訾苗苗：参与实验内容及协助收集数据。

所有作者声明不存在利益冲突关系。