经皮穴位电刺激对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制

帅振虹 张婉菁

南方医科大学附属深圳妇幼保健院生殖医学中心，广东深圳 518017

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40 岁之前卵巢功能明显衰退的临床综合征，以月经紊乱同时伴有高促性腺激素和低雌激素为特征，其发病率为1%～3%，且近年来呈明显上升趋势[1]。研究表明，各种原因导致的POI 大都伴随着卵巢颗粒细胞的凋亡，因此卵巢颗粒细胞过度凋亡可能成为POI 发病的始动因素[2-4]。经皮穴位电刺激（transcutaneous electric acupoint stimulation，TEAS）是以电刺激信号代替传统针灸机械刺激的一种新型针灸疗法，具有无创、易操作、能定量控制时间和强度等优点。研究发现，TEAS 在治疗POI 生殖内分泌紊乱方面取得了良好的临床效果，但关于TEAS 对POI 卵巢颗粒细胞凋亡的影响尚鲜见报道[5]。本研究旨在观察TEAS 对POI 大鼠激素水平的调节及对微小RNA-23a（miR-23a）/SMAD 同源物5（recombinant SMAD family member 5，SMAD5）信号通路的影响，探讨TEAS对POI 模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40 只10～12 周龄SPF 级雌性SD 大鼠，体重210～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[合格证号SYXK（粤）2015-0106；许可证号SCXK（京）2016-0006]。室温控制在22～25 ℃，湿度50%，通风良好。本实验经深圳市妇幼保健院伦理委员会批准（SFYLS[2021]008）。

1.1.2 主要药物

雷公藤多苷片（湖南千金协力制药有限公司，批号：Z43020228）、戊酸雌二醇片（德国拜耳医药有限公司，批号：J20220009）。

1.1.3 主要试剂与仪器

大鼠血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌二醇（estradiol，E2）抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）的ELISA 试剂盒（上海酶联生物有限公司）；电泳仪（美国BIO-RAD 公司）；凝胶成像系统（美国GE 公司）；SDZ-Ⅱ华佗电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；ME204E 电子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，精密度0.01 g）。

1.2 实验方法

1.2.1 POI 大鼠模型构建及分组

每日上午8:00—9:00 时行阴道脱落细胞涂片检查，选取动情周期规则的40 只雌性大鼠，采用随机数字表法将其分成对照组、模型组、TEAS 组、激素组，除对照组外，其余30 只大鼠均使用雷公藤多苷片灌胃造模，每日上午给予生理盐水配制的雷公藤多苷片悬浮液按50 mg/kg 连续灌胃14 d。对照组给予等量生理盐水灌胃。当大鼠阴道脱落细胞涂片显示动情周期紊乱时提示造模成功[6-8]。

1.2.2 干预方法

于造模结束后次日开始干预，TEAS 组参照《实验针灸学》[9]选取关元、肾俞、双侧子宫及三阴交穴，用电子针疗仪予连续波、频率2 Hz、刺激强度以刺激点出现轻微肌肉节律收缩为宜，20 min/次[10]。激素组给予戊酸雌二醇溶液1 mg/（kg·d）进行灌胃。对照组和模型组仅给予抓取和固定，不予任何治疗。各组均为2 次/d，连续2 周。TEAS 干预结束后第2 天，腹股沟静脉取血，分离血清，用于检测血清性激素的表达。处死大鼠，开腹取出两侧卵巢，左侧卵巢放于4%多聚甲醛溶液中，用于TUNEL 检测；右侧卵巢迅速用液氮保存，用于Western blot 实验。

1.2.3 检测指标及方法

1.2.3.1 血清性激素水平检测 各组大鼠TEAS 或灌胃结束后第2 天，腹股沟静脉取血，离心半径8 cm，离心速度4 000 r/min，10 min，按照ELISA 试剂盒说明书操作，检测血清FSH、E2、AMH 水平。

1.2.3.2 TUNEL 染色法检测卵巢颗粒细胞凋亡率 对卵巢组织切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇及水合；蛋白酶K 工作液处理组织15～30 min；滴加50 μl TUNEL（试剂A5 μl+试剂B45 μl）反应混合液于标本上，室温孵育1 h；载玻片晾干后滴加50 μl 转化剂POD 液，室温孵育30 min；滴加50～100 μl DAB 底物溶液，室温显色10 min；用苏木精染液复染后立即用自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；滴一滴PBS 于视野下，用光学显微镜观察凋亡颗粒细胞数并拍照，计数TUNEL 阳性细胞相对于总细胞的百分率。

1.2.3.3 Westernblot 检测 卵巢中miR-23a、SMAD5、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate proteinase 3，Caspase-3）蛋白表达BCA 法测定蛋白浓度，取25～50 μg 蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，室温封闭1 h 后4℃过夜孵育一抗，用PBST 洗涤5 次后室温孵育二抗1 h，用PBST 洗涤5次后将PVDF 膜进行ECL 化学发光显影，采用Image J软件分析蛋白灰度值，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清性激素水平比较

与对照组比较，模型组大鼠血清E2、AMH 水平降低，FSH 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，TEAS 组大鼠血清E2、AMH 水平均上升，FSH 水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清性激素水平比较（）

表1 各组大鼠血清性激素水平比较（）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；TEAS：经皮穴位电刺激；FSH：卵泡刺激素；E2：雌二醇；AMH：抗米勒管激素。

2.2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较

与对照组比较，模型组颗粒细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，TEAS组大鼠颗粒细胞凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较（%，）

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较（%，）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；TEAS：经皮穴位电刺激。

2.3 各组大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 的蛋白表达比较

与对照组比较，模型组大鼠卵巢SMAD5 蛋白表达减少，而miR-23a、Caspase-3 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，TEAS 组大鼠卵巢SMAD5 蛋白表达增加，miR-23a、Caspase-3 蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表3。

图1 各组大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白的表达

表3 各组大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表达比较（）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；TEAS：经皮穴位电刺激；SMAD5：SMAD 同源物5；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

3 讨论

祖国医学认为POI 属于“月经后期、闭经、不孕症”等范畴。中医学认为肾精匮乏、冲任虚衰是其基本病机，肝郁脾虚是发病的关键因素。本研究选取双侧子宫及三阴交为主穴，关元、肾俞为配穴[11]。子宫穴为经外奇穴，与胞宫相邻，具有局部治疗作用；三阴交为三条阴经的交会穴，有通调冲任的作用；关元为任脉之穴，能健脾和胃、调经理气；肾俞穴是肾的背腧穴，能补益肾精。纵观诸穴配伍，以补肾填精为主，使肾精充足而天癸盛，再通调冲任、养血行气使精充血足，经血有了物质基础，营血充盛，阴阳调和，五志七情调畅，诸证可解。

颗粒细胞是卵泡的主要功能单位，对卵母细胞发育起着重要的调控作用[12]。POI 卵泡发育异常以窦卵泡发育阻滞在2～3 mm 阶段、颗粒细胞过度凋亡引起的卵泡闭锁加速导致卵子质量下降为主要特征[13-14]。因此，颗粒细胞过度凋亡是触发POI 的机制之一。研究表明，与卵巢功能正常的女性比较，miR-23a 在POI女性的血浆和颗粒细胞中的表达显著上调[15-17]。作为miR-23a 靶基因之一的SMAD5 是一种受体调控的SMAD 蛋白，可通过激活Caspase-3 蛋白直接影响颗粒细胞凋亡[18-19]。

研究阐明，针刺对POI 女性下丘脑-垂体-卵巢轴有良性调整作用，但具体机制尚不明确[20-25]。本研究采用的TEAS 是以电刺激信号代替传统针灸机械刺激的一种新型针灸疗法，通过雷公藤多苷建立POI 模型大鼠基础上，观察TEAS 对POI 模型大鼠血清激素水平的影响，证实了TEAS 的治疗效果；进一步观察结果显示，TEAS 能上调SMAD5 蛋白表达，下调miR-23a、Caspase-3 蛋白表达，提示TEAS 可能通过调节miR-23a/SMAD5 信号通路，下调促凋亡蛋白的表达，从而抑制颗粒细胞过度凋亡，减少卵泡闭锁，改善卵巢功能。但是否存在其他作用机制，在今后的研究中有待进一步探索。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。