基于搭建紫外-可见光谱仪并运用于氨基酸测定的实验教学模式

刘永刚，唐 妍，吴 佳，曹亚焜

（1.西南科技大学分析测试中心，四川绵阳 621010；2.西南科技大学环境友好能源材料国家重点实验室，四川绵阳 621010）

1 概述

近代分析化学的发展离不开仪器分析，仪器分析是科学研究、工业、医学等许多其他领域的关键工具，在对物质的定性、定量分析以及结构分析中发挥着至关重要的作用。紫外-可见吸收光谱仪可用于分析样品的结构和化学键信息，对吸收峰进行定性鉴别和定量测量，研究化学反应的动力学过程等[1-3]。在实验教学中，通过亲自组装紫外光谱仪，并利用量子化学原理计算样品的紫外光谱，可以有效地加强学生的实验操作技巧和科学知识储备，以提高学生科学素养。学生将学习实践中的物理光学原理以及计算化学方法，帮助他们加深对这些基础概念的理解。2020年，马品一等人通过搭建由氘灯、钨灯和CCD传感器组成的紫外可见光谱仪绘制了铝的不同络合物的吸收曲线，并进行了微量铝的测定[4]。在2023年，赵浩及其团队成功构建了一种光学多通道分光光度计[5]。与常规的单光束和双光束分光光度计相比，这种设备能更迅速地检测到所有波长段的信息，使其成为进行快速反应动力学研究和多组分混合物分析的理想工具。为将具体的实验过程与抽象的理论知识相结合，引入量子化学计算对实验结果进行核对分析，有助于培养学生严谨的科研态度和科学素养。量子化学以量子力学作为其基础理论，通过对原子、分子、晶体的电子结构、化学键理论、分子间的相互作用力以及化学反应理论的研究，揭示了有机、无机化合物，生物大分子物质以及化学反应的内在性质和规律。具体包括从头算、半经验和密度泛函等方法[6-7]。

2 实验教学过程

本实验教学设计融合了现代分析测试仪器搭建和量子化学计算（QC），在教学过程中学生根据课题自主查阅文献，了解紫外-可见光谱仪的原理及在科学研究和工业应用中的重要性，选择合适的光源、光栅、CCD探测器等搭建紫外-可见光谱仪。氨基酸紫外光谱测定的流程为：

1）调研测量方案并与老师讨论合理性。

2）选择测试样品为L-苯丙氨酸与L-酪氨酸并进行预制备。

3）确定所需的波长范围、光度精度和分辨率。

4）使用搭建好的光谱仪对样品进行测量。

5）从Pubchem数据库中检索获得酪氨酸等氨基酸的初始结构模型，采用密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论（TDDFT）对这两种氨基酸进行量子化学计算。

6）对测得的数据进行处理和分析，与计算所得结果进行对比分析，解释光谱中的特征峰。

3 实验教学实施

3.1 紫外-可见光谱的搭建装置搭建

学生根据图1(a)的指示建立光路，选用卤钨灯和氘灯作为光源，它们可以提供可见光区（卤钨灯）和紫外光区（氘灯）的连续光。从光源发射的复合光线经过光阑和凸透镜后，转化为平行光束并穿过样品。再通过凸透镜聚焦过狭缝后，经过凹面镜反射在光栅上，经过另一凹面镜再次反射进入检测器。

图1 紫外可见光谱仪的光路图(a)、紫外光谱仪的光路调节(b)、紫外-可见光谱仪的搭建实物图(c)

3.2 紫外-可见光谱仪的搭建装置校准

光路搭建好后，需进行仪器校准，光学元件在空间中有3个自由度：水平位置、垂直高度和倾角直接决定了光的路径和强度，这些因素对最终结果的精确性有直接影响，因此需要进行仔细的调整[8]。利用实验室常用的高强度激光和光高度计对上面这些光学元件进行垂直高度的调节。先确认光源水平，再使得各个光学元件等高，光斑位于中心，让激光射入球面镜的中心，反射的激光不需要穿过高孔，水平位置，倾角的调节需要在高度调节之后完成。通过不断移动CCD，当观察到CCD上反射的像是最清晰的时候进行固定，如图1(b)所示。在光路搭建完毕后，仍需要对各部件的位置进行微小的调整，直至得到正确的光源光谱，到此一台较为精准的紫外-可见光谱仪调节最终完成，可直接用于后续样品测定。图1(c)展示了已经搭建完成的紫外-可见光谱仪的实物图。

3.3 两种氨基酸紫外-可见光谱的测定与模拟

采用图1(c)所示的自搭建的紫外-可见光谱仪对待测样品进行检测，检测过程中使用CCD作为检测器来检测样品光信号，紫外可见吸收光谱遵循朗博比尔吸收定律，其表达式为：

式（1）中，A为样品光吸收强度，k为摩尔吸收系数，l为光在样品中穿过的距离，c为溶液浓度，I0为入射光强度，It为光通过样品后剩余光强度。朗博比尔定律是一个有限的定律，适用于浓度较低的溶液，当样品浓度较高时，溶液内粒子间距离减小，受粒子间电荷分布影响，摩尔吸收系数将发生改变，偏离朗博比尔吸收定律，另一方面，溶度过高，透射光强度就会过低，就会受到CCD噪声的影响，从而导致较大的测量误差。为了使学生更好地了解搭建的紫外-可见光谱仪的工作原理，我们对两种氨基酸分别配置了不同浓度进行测试。

分别称取0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g 的L-苯丙氨酸与L-酪氨酸粉末，将称取好的样品分别置入100 mL水溶剂中充分搅拌直至溶解。将仪器打开预热30 min，使光源稳定，使用前需要对仪器进行全面校正检定和校正测试定波长，检查样品池。使用搭建好的紫外-可见光谱仪，保证实验在25 ℃下进行，以配制溶液所采用的溶剂水做参比，波长范围为200～400 nm测得氨基酸的紫外-可见光谱。

从Pubchem数据库中获得氨基酸初始结构，使用Gaussion 09软件包，采用TD-DFT方法计算每种目标物的激发态跃迁能和对应的振子强度，在B3LYP/def2-SVP级别下对结构进行几何优化和振动分析以获得氨基酸稳定的构型，并采用基于密度的溶剂模型（SMD）为氨基酸添加了水溶剂环境，通过频率分析确定没有虚频。优化的各收敛限度为：能量变化（Energy Change）：5.0000×10-6Eh；最大梯度变化（Max. Gradient）：3.0000×10-4Eh/bohr；均方根梯度变化（RMS Gradient）：1.0000×10-4Eh/bohr；最大位移（Max. Displacement）：4.0000×10-3bohr；均方根位移（RMS Displacement）：2.0000×10-3bohr。达到各收敛限度且振动分析无虚频即证明优化完成的结构为分子的最稳定形态。优化后的结构采用相同的计算级别进行激发态能量的计算，计算的激发类型为垂直吸收，得到的激发能和吸收强度拟合得到氨基酸的紫外-可见吸收光谱。

4 结果讨论与分析

为了讨论分析结果的准确性，选择市面上常见的商用传统紫外分光光度计（日本岛津UV-3150）测定了配置好的氨基酸溶液，图2是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的紫外-可见光谱图，直线为量化计算拟合得到的光谱图，点线和划线分别为实验搭建的紫外-可见光谱仪与紫外分光光度计（日本岛津UV-3150）测定得到的光谱图。

图2 L-苯丙氨酸(上)和L-酪氨酸(下)的紫外-可见光谱测定曲线与计算曲线

由表1可知，量化计算结果表明L-苯丙氨酸在275 nm处出现了紫外吸收峰。在0.010 g/L的浓度下通过搭建的紫外-可见光谱仪测量的L-苯丙氨酸紫外吸收峰位置在265 nm，此时浓度较低，由于自搭建仪器信噪比差，导致与计算结果比较偏差最大，偏差为3.6%。在实验教学过程中，同时利用商用紫外分光光度计（日本岛津UV-3150）进行测试比对，发现测得的峰位置偏差在2%以内。L-酪氨酸的紫外吸收峰量化计算结果在260 nm处。浓度为0.010 g/L时，自搭建仪器测得峰位置与计算结果最大偏差为2.3%，其余浓度时与紫外分光光度计（日本岛津UV-3150）测得的峰位置平均偏差为2%以内。通过与商用分光光度计测试结果和量化计算结果很好地验证了自搭建紫外可见分光光度计的准确性。

表1 L-苯丙氨酸与L-酪氨酸不同浓度下的紫外-可见吸收峰，括号内为日本岛津UV-3150测定结果，括号外为自搭建仪器测定结果

5 结束语

本教改实验的研究目标是搭建紫外-可见光谱并引入量子化学计算的教学模型，旨在提高本科阶段学生对于分子结构和光谱分析的理解能力。通过将实践与计算模拟相结合的形式有效地提升了学生在分子光谱学中的学习体验和学术水平。通过在教学中引入光谱模拟软件和量子化学计算工具，我们构建了一个全面的教学模型，使学生能够在计算机上模拟和分析不同分子的光谱图像。这种基于实践的学习方法，大幅度提高了学生对光谱原理和分析方法的理解和掌握能力，在具体的操作实践中，使学生更加深刻地理解紫外光谱仪的工作原理。总之，本教改研究工作为化学教育领域的教学改革提供了一种创新的教学模型，并取得了积极的成果。我们相信，通过更广泛地推广和应用这种基于紫外-可见光谱和量子化学计算的教学模型，将会对培养优秀的化学学生和提升化学教育质量起到积极的推动作用。