巨噬细胞转分化在肾纤维化中的调控机制

杨艳燕 陶涛 罗朋立

肾纤维化是所有慢性肾病发展至终末期肾病的最后共同通路，表现为大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增殖，细胞外基质过度沉积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终造成肾功能丧失。肾移植是治疗各种终末期肾病的有效手段，但术后多种原因可导致移植肾发生纤维化，严重影响受者生存质量。肌成纤维细胞是导致胶原产生和细胞外基质过度沉积的主要细胞类型，是肾纤维化过程中的主要效应细胞[1]，但其来源一直备受争议。既往研究认为，肌成纤维细胞来源于固有成纤维细胞、上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、内皮-间充质转化（endothelial- mesenchymal transition，EndMT）和周细胞等[2-8]。巨噬细胞是炎症和纤维化的关键调节细胞[5-6]，活化的巨噬细胞可以产生和分泌多种炎症因子和趋化因子，参与肾脏炎症反应、细胞外基质代谢、肾小球硬化和肾间质纤维化。研究表明，在一定病理条件下，巨噬细胞也可直接向肌成纤维细胞转分化，导致纤维化，这一过程称为巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化（macrophage-myofibroblast transition，MMT），由巨噬细胞转化而来的肌成纤维细胞占组织中肌成纤维细胞总数的35%～65%[9]。本文就MMT 的特点及调控MMT 可能的分子机制做一综述，旨在为肾纤维化的机制研究提供参考。

1 巨噬细胞概述

1.1 巨噬细胞来源及分类

巨噬细胞源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞是先天性免疫细胞，具有维持组织内稳态和宿主防御功能[10-11]。巨噬细胞根据其来源可分为骨髓来源巨噬细胞和组织固有巨噬细胞；根据其功能、活化程度以及分泌因子的不同，可分为M1 型和M2 型；根据淋巴细胞抗原6C（lymphocyte antigen 6C，Ly6C）水平，又可分为CD11b+/Ly6Chigh、CD11b+/Ly6Cintermediate、CD11b+/Ly6Clow3 个亚型[12]。

1.2 巨噬细胞的异质性与可塑性

巨噬细胞具有高度的异质性和多样性，根据其局部微环境、疾病类型和疾病的不同阶段，表现出不同的表型和明显的功能差异。当巨噬细胞在体外受到γ-干扰素、脂多糖等刺激时，可活化为M1 型，即经典活化型巨噬细胞（classically activated macrophage），启动辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1 型适应性免疫反应，分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6等促炎因子，以及C X C 趋化因子配体（C X C chemokine ligand，CXCL）1、CXCL9、CXCL10 等趋化因子，具有杀死微生物、清除感染等特性，促进组织炎症和损伤[13]。当巨噬细胞在体外受到IL-4、I L-1 0 等刺激或真菌和蠕虫感染时，可活化为M2 型，即替代活化型巨噬细胞（alternatively activated macrophage），诱导Th2 型免疫反应[14]，分泌IL-10、IL-18、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1、单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白等抗炎因子以及CC 趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL17、CCL22 等趋化因子，促进伤口愈合、纤维化形成。随着单细胞RNA 测序技术的应用，发现巨噬细胞存在连续的极化状态，而M1 型和M2 型是适应性反应中连续激活状态的两个极端，这种异质性表型的存在被解释为巨噬细胞在不同刺激下的可塑性。

1.3 巨噬细胞在肾纤维化中的作用

肾纤维化是肾病进展到终末期的主要驱动因素[14-15]。巨噬细胞浸润是肾缺血-再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，IRI）后的常见特征，近期研究表明，结节性硬化症蛋白复合体1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信号通路的负调节因子，通过调节巨噬细胞的极化来影响IRI[16]。在IRI 早期，巨噬细胞中TSC1 缺陷可能导致M1 型巨噬细胞极化，加重肾功能障碍，而在IRI 修复过程中，TSC1 缺陷则减少M2型巨噬细胞极化，减轻肾纤维化。在单侧输尿管梗阻和IRI 模型中发现，造血细胞激酶（hematopoietic cell kinase，HCK）作为Src 家族激酶成员，通过抑制自噬诱导巨噬细胞活化推动肾纤维化[17]。在糖尿病肾病、IgA 肾病中也同样发现巨噬细胞可能加速肾纤维化的发展[18-20]。

2 巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化

2.1 巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化的定义及特点

2014年Nikolic-Paterson 等[21]首次描述了来自骨髓的巨噬细胞可以直接转分化为肌成纤维细胞，导致肾间质纤维化，这一过程被称为MMT，发生转分化的巨噬细胞被称为MMT 细胞。MMT 细胞表现为巨噬细胞（CD68+或F4/80+）和肌成纤维细胞（α-SMA+）标记物共表达，并伴有细胞形态呈梭形改变。

一项研究活组织检查（活检）结果发现巨噬细胞（CD68+）和肌成纤维细胞（α-SMA+）标志物的共表达，且MMT 细胞在活动性纤维化病变中存在，但在无纤维化的急性炎症或无纤维化病变的样本中基本不存在，提示MMT 参与活动性肾纤维化[22]。同时该研究还通过谱系追踪证实在肾纤维化的单侧输尿管梗阻动物模型中有大量α-SMA 和Ⅰ型胶原的F4/80+髓系巨噬细胞表达，提示发生MMT 的巨噬细胞为骨髓源性，且多数共表达CD206，提示发生MMT 的细胞以M2 型为主[22]。另一项同种异体移植肾慢性排斥反应损伤研究结果表明，在慢性排斥反应患者移植肾活检标本中，MMT 细胞（CD68+/α-SMA+）约占肌成纤维细胞总数的50%，同样，在接受Balb/c 肾移植的C57 BL/6J 小鼠中，MMT 细胞在慢性排斥反应的同种异体移植肾间质中构成了重要的细胞群体，提示MMT 与移植肾功能和间质纤维化的严重程度相关，会加速慢性肾移植损伤的间质纤维化[23]。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征相关的肾病主要是由慢性间歇性缺氧引起的组织损伤。在慢性间歇性缺氧大鼠肾脏中观察到盐皮质激素受体激活，可能引起巨噬细胞浸润和MMT，从而导致缺氧条件下肾纤维化[24]。但是依赖于标记物表达和谱系追踪研究MMT 存在一定的局限性，研究专注于巨噬细胞的表型而不是功能。2018年一项研究解决了这个问题，该研究使用条件性敲除C D 4 5+白细胞中的Ⅰ型胶原（标记物Col1α1）小鼠，在单侧输尿管梗阻和腺嘌呤诱导的肾纤维化模型中，肾脏中沉积的Ⅰ型胶原38%～50%来源于骨髓源性细胞[25]。而在另一项研究中，骨髓源性肌成纤维细胞仅占肾脏中总肌成纤维细胞的10%左右[26]。因此，纤维化肾脏中发生MMT 的巨噬细胞来源还需更深入的研究。

在梗阻性肾病、移植肾慢性排斥反应、IgA 肾病、糖尿病肾病等多种肾脏病活检组织中都发现有MMT 现象存在，提示MMT 是造成肾纤维化非常重要、普遍的因素[27-30]。MMT 是促进肾纤维化的一种机制，深入研究这一机制可能会发现肾纤维化的新的药物治疗靶点。

2.2 巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化的调控机制

目前，MMT 的调控机制并未明确，研究最多的是TGF-β1/Smad3 信号通路[31-33]。TGF-β 包含TGFβ1、TGF-β2和TGF-β33 种亚型，绝大多数的实质细胞都可以产生和分泌TGF-β，而一些浸润细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、血小板等也可释放TGF-β。TGFβ 的释放和激活导致细胞外基质生成增多和降解减少，适量的激活可促进正常结构重塑和损伤修复，而过度的释放则将导致器官和组织的纤维化。TGF-β 被认为是导致人类肾病中纤维化的关键因素。TGFβ1也是诱导M2 型巨噬细胞极化的主要因子，并促进纤维化肾脏中肌成纤维细胞的分化和积累，这在LeBleu 等[34]的研究中得到证实，该研究发现在α-SMA+细胞中条件性敲除Tgfbr2 基因（编码TGF-β 受体Ⅱ）后，巨噬细胞浸润减少，肌成纤维细胞的数量减少。值得注意的是，TGF-β1暴露的时间是决定体外细胞表型的一个重要因素。骨髓源性巨噬细胞短期（2 d）暴露于TGF-β1可诱导M2 型极化[35]，但持续的TGF-β1（5～7 d）激活，可诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转分化[21-23]。

TGF-β 受体介导的信号通路中最重要的信号转导分子是具有转录因子功能的Smad 蛋白，因而此通路称为Smad通路。TGF-β/Smad被认为是调控MMT 促进肾组织纤维化的主要调节因子[36]。TGFβ 首先与细胞膜表面的TGF-β 受体Ⅱ结合，形成异二聚体复合物，然后再与TGF-β 受体Ⅰ结合形成四聚体，磷酸化TGF-β 受体Ⅱ近膜GS 区的丝氨酸/苏氨酸残基，使其活化。活化的TGF-β 受体Ⅰ使受体相关性Smad2 和Smad3 磷酸化，后者与Smad4 形成三聚体复合物，复合物进入细胞核内并通过转录调节激活MMT 所需的基因。研究表明，将GFP+Smad3-/-或GFP+Smad3+/+骨髓源性巨噬细胞转输注到经辐射照射后的野生型单侧输尿管梗阻小鼠体内，受损肾脏内产生相同数量的GFP+巨噬细胞，但只有GFP+Smad3+/+巨噬细胞可转分化为GFP+α-SMA+肌成纤维细胞，由巨噬细胞转分化而来的肌成纤维细胞占肌成纤维细胞总数的60%以上，出现肾纤维化，且发生MMT 的巨噬细胞主要为M2 型；体外给予TGF-β1刺激骨髓源性巨噬细胞也可诱导MMT 反应，细胞变成长梭形并表达CD206、α-SMA 和Ⅰ型胶原，当Smad3 缺失，可以阻止M2 型巨噬细胞向MMT 细胞的转分化和进行性肾纤维化，由此证明Smad3 是TGF-β1诱导MMT 和胶原生成所必需的[37]。在同种异体移植肾小鼠模型中，骨髓来源的M2 型巨噬细胞向肌成纤维细胞的转分化也依赖Smad3 调节，敲除Smad3 后MMT细胞数量显著减少，移植肾慢性纤维化程度减轻[23]。

肾纤维化中Smad3 途径另一个确定的靶点是原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src。Src 是一种广泛表达的非受体蛋白酪氨酸激酶，可被多种细胞表面受体触发激活，包括免疫球蛋白受体、部分病原相关分子模式和损伤相关的分子模式受体、受体蛋白酪氨酸激酶、G 蛋白偶联受体和细胞因子受体[38-39]。Src 的激活是肾间质成纤维细胞活化和肾纤维化形成的关键因素[40]。最近Tang 等[41]通过单细胞RNA 测序共鉴定了501 个与MMT 相关的差异表达基因，发现Src 位于TGF-β1诱导MMT 的差异表达基因网络的中心，体外研究中TGF-β1在骨髓源性巨噬细胞中诱导MMT 需要Src，而染色质免疫沉淀表明TGF-β1触发Smad3 结合到Src 的3'非翻译区域以增加其转录，抑制Src 可以有效阻断体内外MMT 的发生，从而抑制肾纤维化。Src 作为TGF-β1/Smad3 介导的MMT 的关键调控因子，揭示了MMT 可能的潜在机制。

近来另一项研究发现神经转录因子Pou4f1 在肾脏纤维化中也是Smad3 的直接靶点，是MMT 的关键下游调控因子[42]。在人类和实验性肾病模型中，Pou4f1 的表达在体内肾纤维化早期和体外骨髓源性巨噬细胞发生MMT 期间达到峰值。依赖于Pou4f1的纤维化基因网络，在转录水平上促进TGF-β1/Smad3 驱动的MMT。当巨噬细胞特异性沉默Pou4f1，可以有效阻止小鼠肾纤维化的进展。氯吡格雷是一种P2Y12 抑制剂，是一种新型的慢性肾病抗纤维化药物，通过单细胞RNA 测序证明，P2Y12 在纤维化肾脏中由巨噬细胞高度表达，通过TGF-β1/Smad3 依赖性机制促进MMT 介导肾纤维化[43]。

3 小结与展望

综上所述，以往的研究主要集中在巨噬细胞是如何通过间接机制推动肾纤维化的。近来通过谱系追踪、单细胞测序、已知细胞类型标记物的共同表达和抑制MMT 的关键机制表明，在肾脏损伤修复过程中，巨噬细胞很可能通过MMT 直接参与肾纤维化形成。值得强调的是，支持MMT 存在的结论与细胞和组织中巨噬细胞和肌成纤维细胞属性的共存以及研究模型中疾病的严重程度有关。为了更好地了解MMT的作用，还需要更好的分子表型来描述这些MMT 细胞的特征，以进一步研究调控MMT 的其他可能分子机制，为新的抗纤维化治疗提供思路。