微量稀释联合平板计数法评价聚维酮碘抗菌活性及其影响因素

2024-04-03 11:35怀文辉彭开松

安徽农业科学 2024年6期

怀文辉彭开松

摘要［目的］建立一种评价聚维酮碘抗菌效果的科学方法，并研究影响其抗菌能力的因素，为聚维酮碘防控水产细菌病提供参考。［方法］采用微量稀释联合平板计数法（包括标测法和模测法）测定了不同厂商和批次聚维酮碘的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，并评估了孵育温度、细菌浓度、培养基浓度、pH、货架期对聚维酮碘最小抑菌浓度的影响。［结果］标测法测得的聚维酮碘对4株渔源多重耐药菌的MIC（213～17 g/m3）和MBC（216～19 g/m3）是臨床使用浓度的数万倍。模测法测得的聚维酮碘对MH可培养水生菌的MIC（27～11 g/m3）和MBC（29～12 g/m3）是临床使用浓度的数百到数千倍。试验体系的温度（5 ℃到35 ℃）越高、细菌浓度（103到108 cfu/mL）越大、培养基浓度（0.082～21 g/L，MH）越大、pH（5.5到9.5）越高，聚维酮碘对细菌的MIC越大。聚维酮碘固态原粉货架期为18个月，而聚维酮碘溶液货架期约3个月。［结论］聚维酮碘对渔源致病菌和水生MH可培养菌的MIC远远高于临床使用浓度；水温、pH、培养基浓度、细菌浓度都影响抗菌活性；聚维酮碘固体稳定性远高于其水溶液。

关键词聚维酮碘；微量稀释联合平板计数法；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度

中图分类号 S94 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）06-0093-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Microdilution Combined with Plate Counting Method for Evaluating the Antibacterial Activity of Povidone Iodine and Its Influencing Factors

HUAI Wen-hui1， PENG Kai-song2

（1. Quanjiao County Agricultural and Rural Bureau， Chuzhou， Anhui 239599;2. Lab of Aquatic Health and Fishery Medicine Creation， Department of Fisheries， College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract ［Objective］ To establish a scientific method for evaluating the antibacterial effect of povidone iodine （PVP-I） and study the factors affecting its antibacterial ability， providing reference for the prevention and control of aquatic bacterial diseases with PVP-I. ［Method］ This study used a microdilution combined with plate counting method， further divided into standard measurement method and analog measurement method， to determine the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of PVP-I from different manufacturers and batches. The effects of incubation temperature， bacterial concentration， medium concentration， pH， and shelf life on the minimum inhibitory concentration of PVP-I were evaluated. ［Result］ The MIC （213-17 g/m3） and MBC （216-19 g/m3） of PVP-I against four strains of multidrug-resistant fishing bacteria measured by the calibration method were tens of thousands of times higher than the clinical concentrations used. The MIC （27-11 g/m3） and MBC （29-12 g/m3） of PVP-I on MH cultivable aquatic bacteria measured by the modeling method are hundreds to thousands of times higher than clinical concentrations. The higher the temperature of the experimental system （5 ℃ -35 ℃）， the higher the bacterial concentration （103-108 cfu/mL）， the higher the medium concentration （0.082-21 g/L， MH）， and the higher the pH （5.5-9.5）， the greater the MIC of PVP-I on bacteria. The shelf life of povidone iodine solid raw powder is at least 18 months， and the shelf life of povidone iodine solution is about 3 months. ［Conclusion］ The MIC of PVP-I against pathogenic bacteria from fishing sources and cultivable aquatic MH bacteria is much higher than the clinical use concentration;water temperature， pH， medium concentration， and bacterial concentration all affect antibacterial activity;the solid stability of PVP-I is much higher than its aqueous solution.

Key words Povidone-iodine;Microdilution combined with plate counting method;Minimum inhibitory concentration;Minimum bactericidal concentration

聚维酮碘是广谱消毒剂，在农牧渔业上的用量占其总量的50%以上。聚维酮碘溶液（水产用）是国家批准的使用最广泛的水体消毒剂。但是近年来，“聚维酮碘全池泼洒无法防治常见多发细菌性疾病”的案例越来越多。

聚维酮碘溶液（兽用）和（医用）以冲洗（0.1%聚维酮碘）、浸泡（0.5%～1.0%聚维酮碘）和涂抹（5%聚维酮碘）方式使用，聚维酮碘最低使用浓度为1 000 g/m3（以聚维酮碘计）［1］。而聚维酮碘溶液（水产用）全池泼洒使用的最低浓度为0.45 g/m3（以聚维酮碘计）。聚维酮碘消毒最低剂量在兽用和水产用时有2 222倍的差异，成了聚维酮碘溶液（水产用）全池泼洒被质疑无效的主要依据。

聚维酮碘溶液（水产用）的现有药效评价方法也备受质疑。《水产养殖用抗菌药物药效试验技术指导原则》中采用杀菌率评价消毒剂杀菌效力［2］，该方法中有中和步骤，不符合渔业水体消毒实践；且杀菌率结果无法直接指导临床用药剂量。虽然，有不少研究者采用试管二倍比稀释法测定聚维酮碘对细菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），但关键技术参数并未统一，这必然影响检测结果，也导致试验结果无法比较［3-10］。

综上，聚维酮碘溶液（水产用）的使用效果、说明书用量和药效评价方法，均受到了诸多质疑。因此，有必要建立一种更直接的适合水产养殖实际用药情况的消毒剂药效定量评价方法。该研究在参考抗生素微量肉汤稀释法的基础上，建立了微量稀释联合平板计数法的新方法，并用于研究聚维酮碘药效的影响因素，以期为聚维酮碘在水产上的科学使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和消毒剂

以全基因组序列明确的4株多重耐药性病菌为测试菌，依次为大肠杆菌（Escherichia coli strain E105）（NZ_CP071375.1）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii strain AV040）（CP095841.1）、副炭疽芽孢杆菌（Bacillus paranthracis strain BC006）（NZ_CP119629.1）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain B14）（CP127164.1），上述菌株分别分离自温州光唇鱼、大口黑鲈、鳊鱼和克氏原螯虾。

10%聚维酮碘溶液（有效碘1%）均采集自安徽省境內的养殖场或销售门店，以厂商和批号为标识，分别为武汉兴旺生物技术发展有限公司（简称“兴旺”，20211013），武汉中博水产生物技术有限公司（简称“中博”，20210802），广州市和生堂动物药业有限公司（简称“和生堂”，20210501、20220501、20230305），安徽万士生物制药有限公司（简称“万士”，20210415、20220603、20230528），四川佳泰动物药业有限公司（简称“佳泰”，20220216），广州金水动物保健品有限公司（简称“金水”，20221202），湖南裕翔生物科技有限公司（简称“裕翔”，20230109），无锡中水渔药有限公司（简称“中水”，20230327）。阳性对照为蓝月亮84消毒液（蓝月亮（天津）有限公司，20200807）和仁和医用碘伏消毒液（唐派医疗有限公司，20220602）。聚维酮碘原粉（有效碘10%）为博爱新开源医疗科技集团股份有限公司生产（20210207）。10%聚维酮碘溶液（均标识为有效碘1%）包括4个兽用制剂（和生堂和佳泰，说明书推荐的最低使用浓度为1 000 g/m3）；其余均为水产用制剂（说明书推荐的最低使用浓度为0.45 g/m3）。

1.2 标准微量稀释联合平板计数法测定MIC和MBC

参考邹文腾等［9］的方法，采用标准微量稀释联合平板计数法（简称标测法）进行试验，步骤如下。在96孔板上，依次布100 μL的灭菌水、布100 μL的聚维酮碘工作液（2n g/m3）并依次2倍比稀释、布100 μL细菌工作液（MH稀释的对数期细菌为1×106～2×106 cfu/mL，并采用平板计数确定起始细菌浓度），同时设阳性对照（无消毒剂、有测试菌）和阴性对照。96孔板28℃培养16～18 h后，以第1～10列中的清亮孔和浑浊孔分界处清亮孔所对应的消毒剂最低终浓度为MIC。以杀死99.9%供试细菌所需的最低药物浓度为最小杀菌浓度（MBC）。测定体系起始细菌浓度约为5×105 cfu/mL，在MIC判读时，MIC孔及以前孔所对应细菌浓度一般不超过108 cfu/mL数量级；取清亮孔中100 μL样品涂布MHA平板，28 ℃培养16～18 h，平板上菌落数不大于50者所对应药物浓度被判定为MBC。该研究中的MIC和MBC值均取以2为底的对数，这样更容易比较MIC和MBC之间的关系。

1.3 标测法评估抽检聚维酮碘药效

2021—2023年在安徽省市场上收集10%聚维酮碘溶液，按1.2方法测定MIC和MBC。试验时样品应在生产批号后的90天左右，主要是因为出厂期3个月左右的10%聚维酮碘溶液药效未降低。

1.4 模拟全池泼洒的微量稀释联合平板计数法测定MIC和MBC

在4～6月，从定远县和全椒县的代表性精养池塘（主养鲈鱼、鲫鱼、草鱼）、非水源水库、稻虾田取水样，4 ℃车载冰箱运送到实验室后，立刻在“标测法”基础上改良为“模测法”测定聚维酮碘对MH可培养菌的MIC和MBC。鲈鱼池、鲫鱼池、水库、草鱼池、稻虾田的水样pH分别为8.45、8.43、8.22、8.16和8.23，MH可培养细菌的浓度依次为3.8×106、2.5×105、3.5×105、4.1×104和3.6×103 cfu/mL，水体干物质分别为0.12、0.13、0.08、0.08和0.03 g/L。具体步骤为，依次布100 μL水样水（采用平板计数确定起始细菌浓度）、布100 μL聚维酮碘工作液（2n g/m3）并依次进行2倍比稀释，同时设阳性对照（无消毒剂、有灭菌水、水样和MH）和阴性对照（有灭菌水和MH）。聚维酮碘与水生菌共孵育6 h后，采用MHA进行平板计数，求各孔细菌浓度。计算BCR=（MIC测定中起始细菌浓度）/（MIC判读时各孔的细菌浓度）。当10-3

1.5 聚维酮碘MIC的影响因素研究

采用“1.2”的标准测法，评价孵育温度、起始细菌浓度、培养基浓度、pH、货架期等对聚维酮碘MIC的影响，试验使用聚维酮碘浓度为10%。

2 结果与分析

2.1 方法可靠性验证

为了评估该研究所建立方法的可靠性，以医用84消毒液和仁和碘伏为阳性对照，测定的MIC值见表1。表1显示，两者MIC和MBC的测定值，非常接近说明书推荐的最小使用浓度。这说明该方法可靠，且测得的MIC值和MBC值可供临床用药参考。

2.2 抽检聚维酮碘制剂的MIC和MBC比较

当MBC/MIC ≥ 32，即log2（MBC/MIC）≥ 5时，测试菌对该药物有耐药性。由表2数据可演算出，log2（MBC/MIC）为2、3、4，可见对常用抗生素有多重耐药性的4株测试菌对聚维酮碘仍然敏感。

12批次聚维酮碘对4个测试菌株的MIC值在213～217即8 192～131 072 g/m3之间，最大值是最小值的16倍；MBC值在216～219即65 536～524 288 g/m3 之间，最大值是最小值的8倍。同种制剂对不同细菌的MIC值可能相同或相差2倍，而MBC值可能相同或相差2～4倍。

4个兽用样品，MIC测定值与说明书最低使用浓度比值为8～131；而8个水产用样品，MIC测定值与说明书最低使用浓度比为18 204～72 818。说明该方法实测水产用聚维酮碘的MIC值是推荐使用最小濃度的数万倍。

2.3 模拟聚维酮碘全池泼洒消毒养殖水测定MIC和MBC

由表3可知，4个聚维酮碘杀灭代表性水样中可培养菌的MIC范围为27～211即128～2 048 g/m3，MIC测定值与说明书最小使用浓度比值为 284～4 551倍；而MBC范围为29～212即512～4 096 g/m3，MBC测定值与说明书最小使用浓度比值为 1 138～9 102倍。也就是该方法的实测值是推荐使用最低浓度的数百到数千倍。

2.4 影响聚维酮碘MIC的试验因素

2.4.1 孵育温度对聚维酮碘MIC的影响。由表4可见，随着孵育温度从5 ℃逐渐上升到35 ℃，MIC逐渐呈现升高趋势，说明在临床应用中高温期使用聚维酮碘时，可能需要适当提高浓度，才可能达到预期效果。

2.4.2 载菌量对聚维酮碘MIC的影响。由表5可知，随着MIC试验体系中细菌起始终浓度从108 cfu/mL按10倍比递减到103 cfu/mL，聚维酮碘对2种细菌的MIC均呈现降低趋势。因此，对水生细菌浓度高的水体，需要更高浓度的聚维酮碘，才能达到相同消毒效果。

2.4.3 MH浓度对聚维酮碘MIC的影响。MH中干物质浓度为21 g/L。由表6可知，随着评价体系中有机物浓度的依次下降，聚维酮碘对细菌的MIC有依次降低的趋势。

2.3.4

pH对聚维酮碘MIC的影响。《中华人民共和国兽药典（一部）》中10% PVP-I的pH在3.0～6.5，为合格。由表7可知，随着评价体系的pH从5.5升高到9.5，MIC值呈上升趋势。

2.3.5 货架期与保存形态对MIC的影响。聚维酮碘溶液更容易失效，而固态聚维酮碘原粉现用现配，更容易保持药效。聚维酮碘溶液在出厂后3个月药效就开始下降；而固态聚维酮碘药效可以维持到第18个月（表8）。

3 讨论

3.1 方法创新与有效性

前人用“试管二倍比稀释法结合平板计数法”测定聚维酮碘对细菌的MIC和MBC，根据细菌生长动力学理论推算，有些研究者采用的试验参数测定结果符合MIC和MBC的定义［3-4］；而另一些研究者采用试验参数所测得的MIC和MBC值偏大［5-7］。该研究中，标准微量肉汤稀释联合平板计数法的试验参数如下：培养基MH、细菌工作液浓度1×106～2×106 cfu/mL、药物稀释液灭菌RO水、28 ℃培养16～18 h。标测法可靠且更适合高通量检测。

3.2 测定MIC值与临床使用浓度之间差异的分析

王娜等［4］测得的聚维酮碘对某株菌的 MBC是MIC的2倍；而该研究测得的MBC是MIC的4、8或16倍。这提示临床分离细菌对聚维酮碘耐药性增强。聚维酮碘在低浓度时抑制气单胞菌生长，高浓度时杀灭细菌［5］，其对 Aeromonas sp． T1-T6、ATCC7966的MIC为125～250 g/m3，MBC为 4 000～8 000 g/m3。高晓华［11］研究显示，聚维酮碘对 30 株水产致病菌株的MIC为16～1 024 g/m3、MBC为32～4 096 g/m3。该研究测得的聚维酮碘对渔源病原菌的MIC和MBC比前人［3，5，11］测定结果高很多。

前人和该研究结果均显示，测定的聚维酮碘对渔源细菌的MIC和MBC均比水产全池泼洒用最低浓度（0.45 g/m3）高数百倍到数万倍。聚维酮碘（水产用）全池泼洒推荐浓度为0.45～0.75 g/m3，可能并不是从消毒效果角度考虑，而是从聚维酮碘对水生环境和水生动物的安全角度考虑。高晓华［11］研究后认为，聚维酮碘在水产养殖上使用的安全浓度不宜超过1.344 g/m3。熊斌［12］研究显示，聚维酮碘对海水（水温30 ℃，pH 8.0，海水比重1.024）养殖南美白对虾仔虾（1.2 cm，7.7 mg）的安全浓度为0.515 mg/L。

3.3 影响聚维酮碘MIC的因素剖析

何宝时等［13-14］的研究结果显示，温度越低、pH越低，聚维酮碘稳定性越好，这能解释试验温度越低、pH越低，测得的MIC值越小。陈璇等［3］采用无菌水、NB和2倍NB稀释聚维酮碘开展试验，结果显示，有效碘浓度随培养基浓度升高而降低，说明有机物含量越高对有效碘的中和效果越强，导致其消毒效果越差。该研究结果还显示，聚维酮碘固体的货架期约18个月，比液态的聚维酮碘溶液的货架期（3个月）要长很多，说明固态更有利于保持抗菌活性。

4 结论

水产上聚维酮碘全池泼洒推荐使用浓度0.45～0.75 g/m3，主要不是基于其抗菌活性，而是考虑对水生动物和水环境的安全性。水产病原菌对聚维酮碘的耐药性有增加趋势。温度越高、pH越高、有机物浓度越高、细菌浓度越高，聚维酮碘对细菌的MIC越高，其抗菌活性越差。聚维酮碘粉末比其水溶液的货架期更长。

参考文献

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