GC-MS 结合化学计量学方法分析桂花净油分子蒸馏馏分的挥发性成分

郭智鑫，郝丹丹，卞建明，谢秋涛，孙亚丽，汪 凯，李高阳，朱向荣,*

（1.湖南大学生物学院隆平分院，湖南长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南长沙 410125；3.红牛维他命饮料（湖北）有限公司，湖北咸宁 437000）

桂花（Osmanthus fragransLour.）是我国传统名花之一，属木犀科木犀属植物[1]，主要包括4 个品种：金桂、银桂、丹桂和四季桂[2]。桂花净油是桂花经过提取获得具有独特香味的浸膏后，再使用乙醇对桂花浸膏脱除蜡质后得到的产品[3]。桂花净油具有改善睡眠、镇咳祛痰和提高免疫力等功效[2]，是一种不能人工合成的高级天然香料[4-5]。桂花净油具有天然绿色、环保安全和可药食两用的特点，其需求量与应用范围不断增加[6]，被广泛用于食品和医药等领域[7-8]。

现阶段桂花浸膏提取主要采用溶剂提取法[9-10]、超临界CO2萃取法[11]和亚临界流体萃取[12-13]等方法。溶剂提取法提取率较高，但提取纯度较低，溶剂残留难以除去[9-10]；超临界CO2萃取技术所获取净油的蜡质含量较高[11]。亚临界萃取具有可较好地保留桂花中的天然组分，具有提取率与纯度较高的特点[12-13]。提取得到的桂花浸膏含有大量蜡质，因此需要对其进行分离纯化得到桂花净油。

分子蒸馏技术是一种在高真空条件下进行高效液-液分离纯化技术，该技术主要根据不同物质分子运动平均自由程的不同，从而对物质进行分离纯化[14-15]。对于桂花净油的分离纯化，分子蒸馏技术具有操作条件简单，适用于桂花净油这类热敏性强、易氧化物质的分离提取，其具有分离效率高等优点，在分离过程可有效降低杂质，保障提取物质不受污染，保持其原有品质[15]。目前分子蒸馏技术具有广阔的发展前景，已被广泛应用于香精香料提取[16-17]、油脂精炼[18]等领域。但采用分子蒸馏技术分离纯化桂花净油进行挥发性成分的相关研究鲜有报道。

因此，本文首先采用亚临界技术提取干桂花得到桂花浸膏，再采用分子蒸馏技术对脱蜡后的桂花净油进行分离纯化，并对各馏分物质进行气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，最后采用化学计量学方法建立桂花净油各馏分挥发性成分的判别模型与相对气味活度值（Relative odor activity value，ROAV）建立香气轮廓，评价各馏分差异性挥发性成分与香气特征。本研究将为分子蒸馏技术纯化桂花净油的馏分鉴别及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

咸宁金桂桂花 于2022 年10 月于湖北省咸宁市桂花种植基地采摘，共计100 kg，采后立即进行分选，剔除杂质后，在-4 ℃冷库进行预冷处理，冷链运输至实验室进行真空冷冻干燥处理后，20 目粉碎，装入PE 密封袋，置于干燥皿保存备用；正丁烷、石油醚、无水乙醇、无水硫酸钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；正己烷 色谱级，德国默克Merck 公司。

LGJ-25C 型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；HBS-2500C 高速粉碎机 东莞市华太电器有限公司；FC204 电子天平 上海精密科学仪器有限公司；MS-QP2010Plus 气相质谱联用仪 日本岛津公司；CBE-5L21-14 亚临界提取设备 河南省亚临界生物技术公司；FMD-100 刮膜式玻璃分子蒸馏器 江苏杜马司科学仪器有限公司；Avanti J26XP型冷冻离心机 美国 Beckman 公司；SN-MS-H280D磁力搅拌器 上海尚普仪器设备有限公司；SNR1005 旋转蒸发仪 上海尚普仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桂花净油提取及纯化 准确称取1 kg 干桂花，粉碎过20 目筛后装入绢布袋，置于亚临界萃取设备萃取罐中，采用正丁烷进行提取，料液比1:25 g/mL，提取温度45 ℃，单次提取时间为30 min，萃取三次，减压蒸馏后得到萃取物；根据国标GB/T 14458-2013《香花浸膏检验方法》方法对桂花浸膏进行脱蜡处理后，在条件为-20 ℃，12000 r/min 下进行冷冻离心分离蜡质后，得到桂花净油。采用分子蒸馏技术进行分离纯化，桂花净油样品置于主蒸发器中，刮膜式分子蒸馏器的参数条件调节至：蒸馏温度170 ℃，冷凝温度60 ℃，真空度17 Pa，刮膜转速300 r/min，待样品蒸馏完毕后，轻组分与重组分分别进入收集瓶中，残留组分由外置冷凝器与冷阱捕捉回收，最终得到桂花净油各馏出物。

1.2.2 桂花净油各馏分挥发性成分的GC-MS 测定

取上述桂花净油各馏分样品10 g，用正己烷稀释并定容至10 mL，取1.5 mL 的稀释液进行GC-MS分析。色谱条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量1.0 μL；进样时间：2 min；载气He，柱流量1.05 mL/min，总流量9.3 mL/min；进样模式：不分流；进样温度250 ℃；柱箱温度：50 ℃；升温程序：起始温度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 速率升温至100 ℃，保持2 min；然后以5 ℃/min 速率升温至230 ℃，保持20 min；再以5 ℃/min 速率升温至300 ℃，保持20 min。

质谱条件：EI 离子源；离子源温度：300 ℃；电子能量70 eV；发射电流：34.6 μA；扫描质量范围m/z 45～450。

定量定性分析：移取C7～C40正构烷烃混合标准品，用正己烷溶剂将其稀释为质量分数为1%的标准溶液，以液体进样的形式，按照上述方法条件进样分离，记录各成分保留时间。保留指数RI 值（Retention index）根据 Kovats 公式进行计算，如式（1）所示：

式中：RI 为测量成分的保留指数； R Tx为待测挥发物的保留时间（min）；n 和n+1 分别为正构烷烃的碳原子数；R Tn＜ R Tx＜ R Tn+1。

样品经过GC-MS 分析得到的质谱数据与NIST 14 标准谱库相匹配，计算各挥发性成分的保留指数并参考相关文献定性确定化合物，仅保留匹配度大于80%的成分，对其成分进行定性分析；采用各挥发性化合物峰面积占总峰面积比值表示相对含量计算各成分的相对百分含有量。

1.2.3 桂花净油各馏分挥发性成分的相对气味活度值计算 根据陈卓[19]与王赟等[20]的方法略作修改，采用ROAV 对GC-MS 所获取得到化合物的相对含量数据进行分析，计算公式如下：

式中：Ci为GC-MS 数据通过峰面积归一化法计算获得化合物的相对含量（%）；Ti为化合物i 的在水中的香气阈值（mg/kg）；Tmax为样品中对香气贡献最大成分的香气阈值（mg/kg）；Cmax为对样品风味贡献最大成分的相对含量（%）；当ROAV＞1 时，说明该香气成分为此样品的关键香气贡献成分。

1.3 数据处理

实验重复3 次，GC-MS 分析得到的质谱数据与NIST 14 标准谱库相匹配，最终以各挥发性化合物峰面积占总峰面积比值表示相对含量。数据使用Excel 2010 软件进行统计；GC-MS 数据均以（平均值±标准差）表示；使用SPSS 16.0 软件对GC-MS 数据获取的挥发性成分数据进行方差分析和Duncan 法多重比较，P＜0.05 表示显著；使用Orgrin 2023b软件绘制韦恩图、聚类热图与PCA 图；采用SIMCA软件绘制OPLS-DA 图。

2 结果与分析

2.1 GC-MS 检测结果分析

采用GC-MS 对桂花净油分子蒸馏后得到三种馏分的挥发性成分进行检测，以峰面积法计算其相对含量，如表1 所示，共检测到8 大类挥发性成分73 种，其中醇类22 种、醛类5 种、酸类10 种、酚类3 种、酮类5 种、酯类17 种、烷烃类5 种、烯萜类6 种。

表1 桂花净油各馏分的挥发性成分种类及相对含量Table 1 Types and relative contents of volatile components in different fractions of Osmanthus fragrans absolute

如图1（a）所示，在经分子蒸馏得到的桂花净油轻组分、重组分和残留物组分中，分别鉴定出50、43 和24 种化合物，其中三种馏分共有成分有11 种，轻组分和重组分共有成分有30 种，轻组分和残留物组分共有成分有13 种，重组分和残留物组分共有成分有12 种。在桂花净油分子蒸馏的轻组分、重组分和残留物组分中检测到18 种、12 种、10 种独有成分。韦恩图显示了桂花净油各馏分的挥发性成分种类具有显著差异（P＜0.05）。

图1 桂花净油各馏分挥发性成分韦恩图（a）及化合物类别分析（b）Fig.1 Venn diagram of volatile components (a) and compound classes analysis (b) of different fractions in Osmanthus fragrans absolute

如图1（b）所示，在桂花净油各馏分中，醇类物质种类与相对含量最高，是桂花净油挥发性成分的主要贡献物质。轻组分含有14 种醇类物质，相对含量为21.46%；重组分含有13 种醇类物质，相对含量为22.62%；残留物组分含有5 种醇类物质，相对含量为30.75%，各馏分之间具有显著差异（P＜0.05）。桂花中芳香活性化合物具有典型的甜桂花的花香和甜味[21-24]，包括芳樟醇、反式氧化芳樟醇、氧化芳樟醇、4-甲氧基苯乙醇、二氢-β-紫罗兰醇。其中芳樟醇在轻组分中相对含量最高为3.98%，反式氧化芳樟醇在残留物组分中相对含量最高为12.22%，氧化芳樟醇在残留物组分中相对含量最高为6.76%，4-甲氧基苯乙醇在轻组分中相对含量最高为1.91%，二氢-β-紫罗兰醇在轻组分中相对含量最高为2.84%。醛类物质的种类与相对含量较少，共鉴定出5 种醛类物质，除熊果醛为轻组分与重组分共有物质外，正十五醛为轻组分独有成分，壬醛与正十六醛为重组分独有成分，辛醛为残留物组分独有成分，醛类物质为桂花净油挥发性香气贡献了草本植物的清香与甜果香味[25]。三种馏分的酸类物质相对含量具有显著性差异（P＜0.05），轻组分相对含量最高为20.14%，其中α-亚麻酸，花生酸等为人体必需营养物质，具有一定保健功能。酮类和酚类物质在桂花净油的三种馏分中种类与相对含量较少，其中β-紫罗兰酮为轻组分与重组分共有成分，具有清新花香味[26]，轻组分中的相对含量最高为0.80%；二氢-β-紫罗兰酮为三种馏分共有成分，具有清新花香味[27]，轻组分中的相对含量最高为3.31%；维生素E 和2,4-二叔丁基苯酚是轻组分与重组分的共有成分，甲基丁香酚是轻组分的独有成分，具有丁香-茴香香气。酯类物质是芳香族化合物的主要类型，决定了桂花的浓郁而独特香味[28]。三种馏分共鉴出17 种酯类物质，轻组分12 种，重组分7 种，残留物组分7 种；三种馏分的长链酯相对含量差异较小，轻组分为12.23%，重组分为15.45%，残留物组分为17.21%。残留物组分中磷酸三异丙基酯含量最高为6.61%，而肉豆蔻酸甲酯、二氢猕猴桃内酯等具有清新甜果香味与花香味的物质，三者并未共有，这可能是导致各馏分之间挥发性香气差异的因素之一[29]。烷烃类物质的感官阈值较高，对桂花净油各馏分的挥发性香气贡献较小，具有定香的作用[30]。烯萜类物质挥发性强，其相对含量与种类较多，石竹烯、β-月桂烯、α-蒎烯是桂花净油各馏分挥发性香气的主要成分[31]，且各馏分之间差异显著（P＜0.05）。

2.2 桂花净油各馏分的挥发性成分OPLS-DA 模型分析

正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）是一种有监督的判别统计方法，可实现对数据进行归一化降维处理，从达到对复杂实验数据可视化及预测判别分析[32-33]。为了更好的对桂花净油的馏分进行区分，通过对表1 中桂花净油各馏分的GC-MS 数据进行OPLS-DA 模型分析，结果如图2 所示。三种馏分挥发性成分在得分图（见图2（a））中实现了馏分种类区分，自变量拟合指数（R2x）为0.900，因变量拟合指数（R2y）为0.994，模型预测指数（Q2）为0.982，对于桂花净油馏分区分的预测率为98.2%。其中轻组分均匀分布在第一象限，残留物组分分布在第二、三象限，重组分均匀分布在第四象限，表明桂花净油不同馏分的挥发性成分存在一定差异。

如图2（b）所示，对桂花净油各馏分的GC-MS数据建立OPLS-DA 模型，进行200 次响应的置换检验，以验证建立的OPLS-DA 模型是否出现过拟合现象[34-35]。置换检验得到R2=0.639，Q2=-0.796，所有左侧的Q2大于右侧，Q2与Y 轴的截距为负值，且R2和Q2的回归线的斜率均大于1，说明该模型未出现拟合现象，具有较好的稳定性和预测能力。

2.3 桂花净油各馏分的差异挥发性成分筛选

变量投影重要性（Variable important in the projection，VIP）可用于筛选出对分子蒸馏后的桂花净油挥发性成分中有重要贡献的物质成分，VIP 值越大，说明对样品组间区分的贡献率越大，组间差异越显著[34]。通过对表1 中桂花净油各馏分的GC-MS 数据进行VIP 值的筛选，结果由图3 可知，VIP 值大于1 的桂花净油挥发性物质共27 种，分别为反式氧化芳樟醇、豆甾醇、α-亚麻酸、α-松油醇、γ-谷甾醇、磷酸三异丙基酯、9,12-十八烯酸丁酯、氧化芳樟醇、芳樟醇、亚麻酸乙酯、5,11,14,17-二十碳四烯酸甲酯、正十五烷、角鲨烯、三癸酸甘油酯、γ-癸内酯、硬脂酸苯酯、棕榈酸、二氢-β-紫罗兰醇、α-蒎烯、苯甲酸苄酯、1-二十七烷烯、生育酚、正十四烷、香叶醇、2-甲基-3-丁烯酸、石竹烯、硬脂酸。

为了进一步分析不同挥发性成分对区分桂花净油各馏分的贡献率，根据P＜0.05 且VIP＞1 的标准，对图3 中筛选出的27 种不同馏分的特征挥发性物质GC-MS 数据进行聚类热图分析，如图4 所示，其中醇类8 种、酸类4 种、酚类1 种、酯类8 种、烯萜类6 种。根据聚类热图中挥发性成分的颜色由绿色至红色，代表其相对含量由高到低，筛选出轻组分含量较突出的11 种挥发性成分，包括α-亚麻酸、豆甾醇、棕榈酸等；重组分较高含量的10 种挥发性成分，包括豆甾醇、γ-谷甾醇、棕榈酸等；残留物组分较高含量的9 种挥发性成分，包括反式氧化芳樟醇、氧化芳樟醇、α-松油醇等。

图4 桂花净油各馏分的差异挥发性成分聚类热图Fig.4 Complex heat map of differential volatile components of different fractions in Osmanthus fragrans absolute

2.4 桂花净油各馏分挥发性成分的ROAV 分析与香气轮廓分析

为了说明桂花净油各馏分挥发性成分的香气特征，本研究通过根据1.2.3 方法对桂花净油各馏分挥发性成分进行ROAV 值的计算分析，结果如表2 所示，轻组分、重组分和残留物组分的关键香气贡献成分（ROAV＞1）分别为14 种、9 种和11 种，在轻组分的挥发性成分中氧化芳樟醇、芳樟醇、香叶醇、二氢-β-紫罗兰醇、正十五醛、熊果醛、甲基丁香酚、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、γ-癸内酯、二氢猕猴桃内酯、肉豆蔻酸甲酯、石竹烯、α-蒎烯，是其关键香气贡献成分（ROAV＞1），为样品贡献了花香味、果香味、草香味、甜味与松木香味；在重组分的挥发性成分中氧化芳樟醇、香叶醇、香叶基香叶醇、熊果醛、壬醛、正十六醛、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、γ-癸内酯是其关键香气贡献成分（ROAV＞1），为样品贡献了花香味、草香味与甜桃果香味；在残留组分的挥发性成分中氧化芳樟醇、反式氧化芳樟醇、香叶醇、α-松油醇、库贝醇、二氢-β-紫罗兰酮、γ-癸内酯、二氢猕猴桃内酯、肉豆蔻酸甲酯、石竹烯、β-月桂烯是其关键香气贡献成分（ROAV＞1），为样品贡献了花香味、甜香味与甜桃果香味。

表2 桂花净油各馏分挥发性成分的ROAV 值Table 2 ROAV values of volatile components of different fractions of Osmanthus fragrans absolute

本研究通过将表2 所示的桂花净油各馏分同类香气属性的关键香气贡献成分（ROAV＞1）ROAV 值相加后，构建桂花净油各馏分挥发性成分的香气轮廓描述雷达图，如图5 所示，花香味在桂花净油轻组分挥发性成分的中香气程度最高，ROAV 值为508.371；草香味在桂花净油重组分挥发性成分的中香气程度最高，ROAV 值为312.230；果香味在残留物组分的挥发性成分中香气程度最高，ROAV 值为126.661。

图5 桂花净油各馏分挥发性成分的香气轮廓描述雷达图Fig.5 Radar plot describing the aroma profile of volatile components of different fractions of Osmanthus fragrans absolute

3 结论

本研究以咸宁金桂为原料，采用分子蒸馏技术对亚临界萃取并脱蜡获得的桂花净油进行纯化分离后，得到轻组分、重组分、残留物组分三种不同馏分，采用GC-MS 技术对其进行挥发性成分分析，结果表明桂花净油各馏分在种类与相对含量上差异显著（P＜0.05），且具有明显的特征区分。桂花净油各馏分中共检测出73 种挥发性成分，其中各馏分的特征性挥发性成分主要以醇类、酸类、酯类、酮类化合物为主。通过OPLS-DA 模型分析，桂花净油的轻组分、重组分与残留物组分的挥发性成分之间存在着明显区分，可验证模型具有较好的稳定性与预测性。基于P-value 与VIP 值，对桂花净油各馏分挥发性品质相关的物质进行筛选，得到27 种相对含量差异显著的挥发性成分后，通过聚类分析可知各馏分中含量突出的挥发性成分种类分别有轻组分11 种、重组分10 种、残留物组分9 种，最后采用ROAV 分析与香气轮廓分析对各馏分挥发性成分进行了整体香气描述，轻组分表现出的花香味、甜味以及松木香味最为浓郁强烈。本研究对经分子蒸馏技术纯化分离后桂花净油的各馏分进行了挥发性成分分析，为桂花净油的各馏分挥发性成分鉴别、香气品质分析以及综合利用提供理论参考。

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