含吡啶类腈类医药中间体废盐对海洋青鳉鱼胚胎的毒性效应

李乾永 梁 川 马正茁 孙哲诚 刘怀淇 徐炎华 刘志英

(南京工业大学环境科学与工程学院,江苏 南京 211816)

自党的十八大报告将生态文明建设纳入五位一体总体布局以来,环保管理日益严格,各地逐步推行工业废水零排放政策,常采用多效蒸发法导致大量工业废盐产生[1]。工业废盐涉及农药、制药、染料等多行业,具有种类繁多、产生量大、成分复杂、毒性强、处理成本高、环境危害大等特点,不能直接作为工业原料利用[2-4]。废盐中的卤代烃类、苯系物类等有机物,已被多国列为优先污染物[5]。同时,废盐易溶解会伴随雨水流失,导致周围环境被进一步污染[6-8]。2019年中国可记录的废盐年产量为2.1×107t[9],对应处理处置市场规模约5.6×1010元。在《危险废物填埋污染控制标准》(GB 18598—2019)[10]实施后,工业废盐处理技术中安全填埋被主要采用。然而,填埋存在潜在的环境和安全风险,而交由固废处置中心处理则需高昂成本[11]。排海处理则可降低废盐处理成本并节约土地资源,2021年《危险废物环境管理指南 化工废盐》[12]中明确了废盐无害化处理后排海的要求。但由于缺乏工业废盐排海的生态环境影响研究,国内对此存在顾虑。研究缺失导致难以评估环境风险,也无法推进排海项目。并且,工业污染物成分复杂多变,难以通过单个或多个污染物进行联合模拟,目前主要以工艺生产流程为区分。

在海洋生态毒理学研究中,选择合适的受试生物对于准确评估毒性至关重要。海洋青鳉鱼(Oryziasmelastigma)作为海洋生态毒理学研究的优秀模式生物,已被国际生命科学学会(ILSI)与健康和环境科学研究所(HESI)认定为毒理学研究的重要工具[13]。相对于其他常用的模式生物,如斑马鱼、孔雀鱼、牙鲆、星点东方鲀、半滑舌鳎等,海洋青鳉鱼具有环境适应性好,可适应盐度为0～35‰、温度为0～40 ℃的水体;体型较小,易于实验室培养;产卵量大,鱼卵体型较大且透明,便于观察;世代周期较短,2～3个月可由胚胎发育为成鱼,且雌、雄鱼易辨别等优势特点[14]3-5,[15]11,[16],[17]106349。海洋青鳉鱼作为新型优秀的海洋生态毒理学研究模式生物,可用于评估外源性化合物的急性或发育毒性。研究内容包括:形态学变化[18-20],如胚胎大小和心率,仔鱼体重、体长、性别比和畸形率等;运动学变化[21]113843,如游泳频率和眼动频率等;再结合生化指标和病理学特征,如性别变化[22]、器官变化[23]、细胞衰亡[24]125537、肠道菌群[25]152945、酶活性和相关化合物含量[26]等;最后,通过组学分析如转录组学[17]106349,[25]152945、蛋白质组学[27]和代谢组学[28]等差异表达来探究外源性化合物的毒性及其深层次的机制。研究结果可为相关外源化合物的环境风险评估和管理提供有力的科学依据。

本研究基于实际工业生产中的问题,选用医药中间体副产废盐及其处理后的除杂盐为实验样品,研究其对海洋青鳉鱼胚胎生长、发育以及酶活性的影响,旨在评估复合污染物废盐在海洋生态环境中的风险,并为废盐排海工程提供实验数据与理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料与受试生物准备

实验使用的废盐来源于某医药中间体企业。废盐原盐经过热化学处理、冷却回溶、过滤除杂,最后蒸发结晶的方式获得除杂盐。

海洋青鳉鱼取自厦门大学,已在实验室稳定培育了两代以上。实验前按雌雄比1.2∶1.0挑选个体健康、无明显畸形的6月龄成鱼。饲养条件:实验用海盐(法国红十字小丑盐,Instant Ocean)按说明溶于经砂芯过滤后的超纯水中,盐度为(30±1)‰,温度为(28±2) ℃,溶解氧>6.0 mg/L,光暗周期为14 h∶10 h,成鱼喂食丰年虾幼虫,每日3次。实验前晚清空缸中鱼卵,次日在光照开始、成鱼产卵的3 h内收集所有胚胎,通过显微镜观察,筛选出已受精的胚胎。

实验试剂盒:总蛋白质、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和溶菌酶(LZM)测定试剂盒。

实验仪器:体视显微镜(SZ61-TR,Olympus)、紫外可见光分光光度计(UV-2600i,Shimadzu)、光照培养箱(HPG-400BX)、手持高速匀浆器(F6/10)、高速冷冻离心机(GL-20G-II)、细胞培养板等。

1.2 废盐分析

对废盐进行X射线衍射(XRD)、电感耦合等离子体(ICP)和总有机碳(TOC)分析,废盐的硫酸根、氯化钠、钙镁离子、水不溶物和水分含量按《制盐工业通用试验方法》(GB/T 13025.x—2012)进行测定。

1.3 急性毒性实验

采用经济合作与发展组织(OECD)鱼类胚胎急性水生毒性实验设计。实验从卵子受精后尽早开始,暴露时间为96 h,最终得出96 h半数致死浓度(LC50)。设置废盐质量浓度为0(对照组)、6、12、18、24、30 g/L,每个浓度设3个生物学平行。在6孔板中进行暴露,每孔加入10枚胚胎与15 mL对应暴露溶液,采用半静态暴露方式,每日换水2/3。每日观察胚胎发育及生命活动情况,统计胚胎死亡数并清除死亡胚胎。实验置于光照培养箱中进行,胚胎孵化的环境参数与成鱼一致。96 h LC50通过概率单位法计算。

在进行所有暴露实验前,将废盐暴露溶液按照相应浓度配置,并将所有暴露溶液补充海盐至盐度为(30±1)‰。

1.4 发育毒性实验

根据急性毒性实验结果,设置废盐质量浓度为0(对照组)、2、4、6、10、14 g/L,同时设置除杂盐质量浓度为30 g/L。使用培养皿(直径10 cm)作为暴露容器,每个培养皿中加入60枚胚胎,每组浓度重复3次。实验环境参数遵循前文描述。每日记录胚胎死亡数和孵化数,观察胚胎发育情况。在5、8受精后天数(dpf)时从每个培养皿中随机挑选10枚胚胎,使用体视显微镜测定心率。测定方法为显微镜下记录30次心跳所需时间并换算成每分钟心率,每个胚胎重复3次。

1.5 系统损伤实验

设置废盐质量浓度为0(对照组)、2、6、14 g/L和除杂盐质量浓度30 g/L进行实验。在5、8 dpf时,取出所需数量的胚胎,使用超纯水将胚胎表面冲洗干净后按照对应试剂盒说明书进行测定。

1.6 数据处理

采用SPSS 20.0软件中的Probit模块进行急性毒性分析。对于发育毒性和系统损伤实验数据,在确保数据符合正态分布和方差齐性的前提下,采用单因素方差分析法和最小显著性检验法(LSD)进行组间差异显著性分析,结果以平均值±标准差的形式表示。分析采用95%(α=0.05)可信限,P<0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 废盐成分分析及暴露溶液TOC分析

对废盐和除杂盐进行XRD、ICP、TOC和纯度分析,结果如表1所示。结果表明废盐和除杂盐主要成分为NaCl,除Al(396.152 nm)外无其他重金属。废盐纯度不符合GB/T 5462—2015[29]中工业干盐二级标准。

表1 成分分析1)

废盐溶解过滤后进行气相色谱/质谱联用(GC/MS)分析,结果表明废盐中有机物主要为吡啶类、腈类有机物。实验所用暴露溶液的TOC结果如图1所示。由图1可见,TOC与废盐浓度呈现显著浓度—剂量关系。

注:含有相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05),反之则差异显著(P<0.05)。后图同。

2.2 急性毒性实验结果

如图2所示,胚胎死亡的主要表现为胚胎凝固变白、无心跳和孵化失败。在96 h的急性毒性实验中,对照组死亡率小于10%,而当废盐为30 g/L时,死亡率大于90%,符合急性毒性实验要求。通过拟合lgC(C为废盐质量浓度,g/L)和96 h死亡率之间的关系曲线(见图3),计算得出废盐对海洋青鳉鱼胚胎的96 h LC50为13.94 g/L。

图2 不同时期的健康胚胎与死亡胚胎

图3 胚胎死亡率和lgC的关系

2.3 发育毒性实验结果

2.3.1 死亡率

不同盐浓度下海洋青鳉鱼在20 d持续暴露期间的累计死亡率和最终死亡率如图4所示。胚胎死亡率随着废盐浓度的升高呈显著递增趋势。除杂盐组的胚胎死亡率为(21.18±1.70)%,显著高于对照组的(12.50±2.16)%(P<0.05),又显著低于废盐实验组(P<0.05)。胚胎死亡的发生时间随废盐浓度的上升而提前,在高浓度废盐溶液(10、14 g/L)暴露下,胚胎死亡主要集中在3～6 dpf,这是因为处于胚胎时期的海洋青鳉鱼解毒功能器官尚未发育完全,对外界环境的抵抗力较弱,在面对外界环境的不良胁迫时,易造成个体死亡[15]44。而在较低浓度时,由于胚胎与废盐接触时间较长,经受的环境胁迫逐渐累计,胚胎死亡与自然孵化出现的时期相似(7～12 dpf),但死亡率显著上升。未经处理的废盐成分复杂、毒性较强,而在经过处理后的除杂盐暴露的海洋青鳉鱼胚胎死亡率大大降低,这与处理后除杂盐中TOC的下降密切相关。

图4 不同盐浓度暴露下胚胎的累计死亡率和最终死亡率

2.3.2 孵化率和孵化时间

不同盐浓度下海洋青鳉鱼持续暴露20 d的孵化率如图5(a)所示。与对照组孵化率相比,废盐实验组和除杂盐实验组的胚胎孵化率均存在显著性差异(P<0.05)。除杂盐实验组孵化率为(78.82±2.17)%,仅低于对照组孵化率的(87.50±2.76)%。

图5 不同盐浓度暴露下胚胎的孵化率和孵化时间

不同盐浓度下海洋青鳉鱼的孵化时间如图5(b)所示,低浓度废盐(4、6 g/L)实验组孵化时间显著高于对照组(P<0.05),而10 g/L的废盐显著降低了胚胎的孵化时间(14 g/L时胚胎全部死亡,故无孵化时间)。这种胚胎受到外界环境刺激后减少孵化时间的现象在其他的研究中也有报道[30],这与环境污染物介导产生大量活性氧(ROS)使海洋青鳉鱼胚胎的抗氧化系统失衡有关[31]106-107。

废盐成分中的吡啶类和腈类有机物的联合作用对海洋青鳉鱼胚胎的生长发育产生了显著影响。当废盐质量浓度为2、4、6 g/L时,孵化时间持续延长,结合废盐成分推测为废盐中的大量污染物附着于胚胎表面(见图6),抑制了胚胎对外界的营养吸收效率。而当废盐质量浓度为10、14 g/L时孵化时间缩短,甚至在一定时间后全部死亡。推测是高浓度废盐的毒性迫使胚胎通过提前孵化而尽可能保证生存的高效繁殖方式有关,这与倪晓敏[14]91-93进行的六价铬长期暴露实验结论一致。同时黄伟等[32]发现,重金属引起孵化腺功能变化会造成孵化过程可能延长或缩短。除杂盐实验组中胚胎孵化时间缩短,可能是因为在胚胎生长发育、器官形成和机体系统平衡等生命过程中微量元素具有极其重要的生物学功能[33]。然而,除杂盐组盐度完全通过除杂盐进行调节,未添加人工海盐,因此缺少了胚胎生命初期中所需要的微量元素和其他金属元素。

图6 表面附着污染物的胚胎

2.3.3 心 率

不同盐浓度暴露下的海洋青鳉鱼胚胎心率如图7所示。5 dpf时,除了6、10 g/L外的实验组心率均显著低于对照组(P<0.05)。8 dpf时,除了4、6 g/L外的实验组心率均显著低于对照组(P<0.05)。HONG等[34]发现,海洋青鳉鱼暴露在六溴环十二烷中5、8 dpf时的胚胎心率会显著增加。在HUANG等[35]的研究中,海洋青鳉鱼胚胎暴露在全氟辛烷磺酸中10 dpf时心率显著降低,而在4、6、8 dpf时又存在不同的结果,且在暴露于4、16 mg/L全氟辛烷磺酸中导致静脉窦(SV)-动脉球(BA)距离增大并改变心率。这与本研究中不同暴露时间不同盐浓度暴露下存在不同的结果类似。

图7 不同暴露时间与盐浓度下的胚胎心率

心脏是胚胎发育过程中的最开始出现功能化的器官之一,其对环境污染物十分敏感[36-37]。胚胎的存活率很大程度上取决于心脏功能是否正常[38-39]。海洋青鳉鱼心脏在5 dpf基本发育完全,此时心脏、头部及其他内脏组织血液循环系统管道也随之发育健全并能够观察到强烈的心跳信息。8 dpf时,胚胎系统基本完成直至孵化出仔鱼[24]125537。多项研究表明,在不同污染物的暴露下海洋青鳉鱼胚胎或斑马鱼胚胎都存在心率紊乱的现象[40-43],这代表着对心脏功能不同程度的损伤。这同样与环境污染物介导的过量ROS有关[31]106-107。不同废盐浓度和暴露时间下孵化的仔鱼中均存在不同程度的心脏拉长和心包囊肿等畸形,而心包囊肿形成会一直影响胚胎发育进而影响心脏结构导致死亡[44]。因此可能是废盐暴露下影响了心脏的正常发育从而导致心率变化。

2.4 系统损伤实验结果

2.4.1 蛋白质含量定量分析

为防止由于匀浆浓度差异对实验结果造成影响,首先测定了实验样本的蛋白质浓度,后续通过均一化方法衡量废盐暴露对海洋青鳉鱼胚胎内生物标志物的影响。蛋白质定量标准曲线拟合方程和定量结果如图8所示。

2.4.2 抗氧化系统损伤

选择SOD、CAT、GSH和GST作为不同废盐浓度暴露下5、8 dpf时胚胎的抗氧化标记物,其检测结果如图9所示。

图9 不同暴露时间与盐浓度下胚胎的抗氧化系统标记物活性或含量

SOD活性在废盐实验组中均呈现随浓度上升而上升的趋势。在5 dpf时,除杂盐组和2、6 g/L的实验组与8 dpf时的除杂盐组和2 g/L实验组的SOD活性显著低于对照组(P<0.05),8 dpf时14 g/L实验组的SOD活性显著高于所有其他组;CAT活性在5、8 dpf时的废盐实验组均显著低于除杂盐组(P<0.05),而除杂盐组与对照组没有显著性差异(P>0.05)。

GSH含量在5 dpf时的14 g/L实验组和8 dpf

时所有实验组中显著低于对照组(P<0.05),且在除杂盐组与对照组没有显著差异(P>0.05);GST活性在5 dpf的除杂盐组和5、8 dpf中所有实验组均显著低于相应对照组(P<0.05)。

GSH是生物体内的重要还原性化学物质,能够清除人体内的自由基。而GST能催化GSH结合各种亲电子的外源化学物,通过有效转化有害物质或减少有机过氧化物以达到排毒效果[49-50]。研究表明,当氧化应激超出机体的防御能力,会降低酶活性并影响抗氧化酶的合成[51]。实验结果表明,废盐暴露下SOD率先发挥作用,活性上升,但GSH含量和GST活性均显著下降,这与CAT的趋势一致,结果与ZHAO等[52]的研究类似,说明胚胎内活性氧超过胚胎防御能力不能被抗氧化系统清除,胚胎中发生了严重的氧化损伤、破坏了胚胎的抗氧化系统,同时也可能影响了胚胎心脏的生长发育和心率并导致孵化时间的变化。

2.4.3 免疫系统

不同暴露时间与盐浓度下海洋青鳉鱼胚胎的LZM活性如图10所示,LZM活性在5、8 dpf时的除杂盐组、废盐实验组均显著低于对照组(P<0.05)。类似的是,JUHEL等[53]的研究中在马卡西平的暴露下,双壳类水生生物体内LZM活性下降。MATOZZO等[54]的研究中在三丁基锡的暴露下,菲律宾蛤蜊的LZM活性下降。LZM参与抗病毒、免疫调节、抗炎和抗肿瘤等生物学功能,常用来评估污染物对生物体免疫系统的毒性作用[55-56]。LZM作为免疫系统中的关键生物标志物,在所有的实验组中均被显著抑制。这表明,不论是成分复杂的废盐还是缺少必要营养物质的除杂盐,均会对海洋青鳉鱼胚胎的免疫系统产生影响。可能的影响包括诱导炎症反应、阻碍免疫功能、产生慢性免疫毒性等,抑制海洋青鳉鱼仔鱼的健康生长[21]113843。

图10 不同暴露时间与盐浓度下胚胎的LZM活性

3 结 论

(1) 实验所选用的医药中间体行业废盐主要污染物成分为吡啶类、腈类有机物。废盐对海洋青鳉鱼胚胎存在急性致死效应,96 h LC50为13.94 g/L。

(2) 废盐对海洋青鳉鱼胚胎存在显著的发育毒性,主要表现为累积死亡率增加、孵化时间改变和心率紊乱。

(3) 废盐暴露导致海洋青鳉鱼胚胎抗氧化系统产生氧化应激及损伤,影响胚胎生长发育。并对免疫系统产生显著影响,威胁种群发展。

(4) 经实验室处理后的除杂盐中有机物含量显著降低,对海洋青鳉鱼胚胎的发育毒性显著降低。除杂盐对海洋青鳉鱼胚胎LZM活性的显著影响可能是由于缺乏正常海水中所含的营养物质所导致的。