丝状噬菌体作为胶质瘤治疗载体的应用进展

宋钰辉 王 忠 张晓军 杨蔚然 张之龙

1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古呼和浩特 010000；2.内蒙古自治区人民医院神经外科，内蒙古呼和浩特 010000

胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，有着致死率高、早期复发率高、死亡率高、临床治愈效果差的特征，由于其毛细血管的广泛增殖使手术往往无法完全切除，5 年生存率＜10%[1]。胶质瘤在以替莫唑胺为主的治疗过程中，容易产生耐药性且不良反应突出，并且由于血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）和血脑肿瘤屏障（blood-brain tumor barrier，BBTB）的存在，大多数抗肿瘤药物难以到达特定组织[1-2]。为了克服现有疗法的局限性，需要一种可以穿越BBB 和BBTB，选择性靶向组织给药并且对非靶向组织毒性作用小的治疗策略。目前研究发现，Ff 噬菌体在进入中枢神经系统的同时不会产生明显的毒性作用，在通过鼻内给药时，它可以作为药物的载体携带药物跨越BBB和BBTB[3-5]。此外，噬菌体展示库可以快速筛选肿瘤靶向肽并建立了跨越BBB 筛选胶质瘤靶向肽的方法，这些靶向胶质瘤细胞的噬菌体不仅可以减少抗癌的毒副作用，并且可以刺激免疫反应达到免疫治疗的效果[3，6]。

1 Ff 噬菌体在胶质瘤治疗中的优势

Ff 噬菌体是由单链环状DNA 及蛋白质外壳组成，其中主要蛋白质外壳PVⅢ位于体侧，次要蛋白质外壳（Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ）位于两端，目前广泛应用于免疫治疗中药物、抗体及抗原肽的传递[7]。随着噬菌体展示技术的发展构建了噬菌体文库用于选择靶向噬菌体，如肿瘤靶向肽，显著提高了Ff 噬菌体研究效率。由于传统的化学治疗药物针对癌症细胞的特异性不足，且同时具有不良反应和药物毒性，所以，靶向治疗对于胶质瘤尤为重要[8-9]。研究表明，靶向治疗的关键是细胞膜对于药物的渗透差，而载体的性质影响了药物在肿瘤组织及受肿瘤影响的相关组织的给药效率[10]。Ff噬菌体相比于目前广泛应用的单克隆抗体可以在穿越BBB 的同时更加有效地附着在细胞膜的表面，进而穿透细胞膜提高给药效率。将Ff 噬菌体与外源肽的DNA 序列结合形成靶向肽在对物理和化学环境具有较强抵抗力的同时可以表达外源肽的蛋白质活性，同时Ff 噬菌体展示外源肽可以与药物相结合形成载药噬菌体用于肿瘤的治疗并降低药物的毒性和副作用[11-12]。在Sartorius 等[13]的研究中发现Ff 噬菌体可以诱导细胞因子白细胞介素-2 和γ 干扰素，增加与肿瘤细胞的亲和力，在提高免疫治疗效率的同时降低了外源肽的细胞毒性及副作用，在目前以替莫唑胺为主的靶向治疗药物在抑制肿瘤细胞的同时会出现肝肾功能损伤、骨髓抑制，因此将Ff 噬菌体应用于胶质瘤治疗会显著降低上述副作用，并取得良好的临床效果。在胃肠道肿瘤的研究中发现，Ff 噬菌体可在穿越胃肠道黏膜的同时起到杀灭细菌的作用，Ff 噬菌体在抗肿瘤增殖的同时也会起到对抗肿瘤继发引起的感染，为胶质瘤靶向治疗提供一定理论基础[14]。

2 Ff 噬菌体在胶质瘤中的应用

2.1 靶向肽和抗体的识别

2.1.1 体外平移 体外平移被用于识别特异性结合胶质瘤细胞或蛋白质。1981 年胶质瘤干细胞特异性结合肽首次被发现，解剖后发现此多肽在注入小鼠体内后可在其颅内聚集，且在肿瘤组织中浓度较高，在正常脑组织中含量较低，表明此多肽可在穿越BBB 后与胶质瘤组织特异性结合，后将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式插入噬菌体表面表达特定蛋白质的生物学特性，且该蛋白质的结构基因存在于噬菌体核心DNA 中[15]。通过噬菌体文库分离出携带GL1 多肽的Ff 噬菌体，将其与人离体胶质瘤组织结合后发现二者可产生特异性相互作用，这间接性提示该Ff 噬菌体可在颅内与肿瘤组织结合。有学者将携带GL1的Ff 噬菌体注入小鼠体内后发现该噬菌体与小鼠肿瘤细胞特异性结合，这在理论上显示携带GL1 多肽的Ff 噬菌体可从噬菌体文库中分离并用于治疗胶质瘤[16]。CD133 是一种可以识别胶质瘤的细胞表面抗原。将靶向CD133 的肽与纳米金相结合发现靶向肽可有效地进入脑细胞外空间，同时蛋白激酶家族可以影响CD133 的表达。学者认为靶向肽在与CD133 结合后可在穿过BBB 后发挥CD133 识别胶质瘤组织的能力，与胶质瘤表面抗原特异性结合后发挥靶向治疗的作用，同时在蛋白激酶的影响下调控CD133 的识别能力进而改善靶向治疗效果[17]。Patil 等[18]发现，胰岛素样生长因子结合蛋白2（insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP2）在胶质瘤组织中水平高度上调并参与了胶质瘤细胞的侵袭，相反IGFBP2 浓度降低对胶质瘤细胞增生起到一定抑制作用，因此IGFBP2 抗体的分离对于神经胶质瘤的治疗极为重要，通过二者结合可降低IGFBP2 浓度。学者从Ff 噬菌体文库中筛选出可以与IGFBP2 特异性结合的肽scFvB7J，在注入小鼠体内后发现二者结合后可以显著降低IGFBP2 浓度，这提示scFv B7J 可作为IGFBP2 的特异性抗体并抑制神经胶质瘤的迁移和侵袭[19]。以上研究结果表明Ff 噬菌体文库可以在体外识别出与神经胶质瘤靶向结合肽，此结合肽在与肿瘤细胞特异性结合的基础上可发挥其识别能力或降低生长因子浓度的特点，在该条件下影响肿瘤细胞的增生，达到靶向治疗的作用，这也为神经胶质瘤治疗提供一种新疗法。

2.1.2 体内平移 体内平移是指在动物模型中获得特异性靶向肽，可以分离肽和抗体，通过神经胶质瘤异种移植物中Ff 噬菌体文库的体内生物淘洗来识别胶质瘤的亚群。一方面，神经胶质瘤具有细胞层次结构，是在顶点具有自我更新能力的胶质瘤起始细胞（glioma initiating cell，GIC）。将Ff 噬菌体文库注入到神经胶质瘤的异种移植物中可获得GIC，该GIC 的生物学特性与神经胶质瘤细胞相同，同时Ff 噬菌体文库中存在可识别并与VAV3 和CD97 的特异性结合得到多肽，此多肽可在穿过BBB 后识别并与GIC 特异性结合，为胶质瘤靶向治疗提供基础[20]。另一方面，对胶质瘤脉管系统的破坏可有效减少肿瘤的血液供应。在神经胶质瘤小鼠模型中通过对Ff 噬菌体文库进行体内生物淘洗后提取出纳米抗体C-C7，将该抗体注入小鼠体内后发现其在肿瘤组织中浓度增高且肿瘤组织旁血管血液供应降低，C-C7 可以识别胶质瘤异种移植物和胶质瘤样本中的肿瘤血管亚群，降低肿瘤血液滋养程度，提高靶向治疗效率[21]。因此在动物模型中进行体内生物淘洗是一种非常实用的手段，在低成本条件下提高了筛选效率，是可以用于识别靶向胶质瘤的分子工具。

2.2 靶向给药载体的选择

由于BBB 和BBTB 的存在使得胶质瘤药物进入中枢神经系统受到限制，其中98%以上的低分子药物不能穿过BBB[22]。因此，有效的胶质瘤治疗药物需要其跨越BBB 和BBTB。目前作用机制较明确的胶质瘤治疗载体以病毒为主，其中主要包括慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒及腺相关病毒，尽管病毒载体在转载效率和安全性等方面得到极大提升，但以慢病毒为主的治疗载体会引起免疫应答，如导致实验动物产生慢性炎症反应和脱髓鞘病变，并且由于其穿透能力差及患者预后改善不佳等原因未应用于临床；在以腺病毒为治疗载体研究中，因其生物学特征较为明确使得该载体在临床应用中产生较好效果，但Ⅰ期临床试验显示转染细胞后在5 mm 范围内可检测出病毒，这表明其组织穿透能力有限[23-24]。在以聚乙烯亚胺、树突状大分子、聚β 子氨基酯为主的聚合物载体系统可穿越BBB 作用于肿瘤细胞，并且此载体更易与配体活性中心结合，通过调整分子量，电荷分布改变胶质瘤治疗效果[25]。然而此载体具有较强的细胞毒性，在杀灭胶质瘤细胞的同时对正常神经细胞产生毒性作用。以蛋白质、多肽、干细胞为主的非病毒基因载体相比于病毒基因载体具有细胞毒性低的特点，然而其稳定性差、转染效率低等特点未应用于临床[26]。由于以上载体在研究过程中出现副作用及细胞毒性较大等问题，现迫切需要一种新载体完成靶向给药过程。

1985 年噬菌体展示技术首先被发现，这项技术的关键是噬菌体上显示的蛋白质与其封装的编码序列之间的物理连接，通过在Ff 噬菌体表面展示多种蛋白质、多肽以及抗体，并且将Ff 噬菌体展示文库注入动物体内以达到筛选靶向肽目的[27]。近几年的研究主要集中在使用载体来改变药物动力学。Porosk 等[28]在使用Ff 噬菌体展示技术的过程中结合细胞穿透肽pVEC 和胶质瘤靶向肽序列gHo 的两种能力开发出靶向药物递送载体gHoPe2。将gHoPe2 注入小鼠模型中发现由于pVEC 细胞穿透能力较强，该载体可以有效穿过BBB 进入中枢神经系统，而gHo 的靶向能力可使gHoPe2 与神经胶质瘤组织特异性结合。并且在小鼠异种移植物模型中，将gHoPe2 与阿霉素结合后发现此结合体比游离阿霉素药效更加有效，但阿霉素对于非肿瘤细胞毒性较大，强制限制治疗并与其他抗癌药物联合使用后发现阿霉素改善了载体的基因传递，不影响载体对癌细胞的选择性并增强了对肿瘤细胞的杀伤能力，此研究证明靶向运送载体gHoPe2 联合阿霉素用于神经胶质瘤治疗具有可行性[29]。

BBTB 是由脑肿瘤毛细血管形成的与BBB 不同的屏障，在靶向给药的过程中会抑制给药效率。Ff 噬菌体文库中存在一种BBB/BBTB 穿透肽M1，将M1靶向修饰成为M1-RGD 后与药物结合形成PDC M1-RGD-PTX，此结合物与传统给药载体相比可以明显提高给药效率，M1 在穿过BBB 的同时也存在较强BBTB 穿透力。将M1 注入小鼠体内后在提高给药效率的同时神经胶质瘤细胞的增殖受到明显抑制，小鼠的存活时间明显延长。这表明M1 可作为穿过BBB/BBTB 的载体，将其修饰后可形成一种与肿瘤特异性结合、抑制肿瘤增殖、提高治疗效率的新载体[30]。以上研究提示从Ff 噬菌体文库中筛选出的靶向肽具有较强的BBB/BBTB 穿透能力及肿瘤组织特异性结合力，将该靶向肽应用于胶质瘤治疗可以弥补传统治疗模式中的不足，通过基因修饰可进一步发挥其优势，并且Ff 噬菌体展示技术在胶质瘤的治疗中也发挥明显作用。

2.3 Ff 噬菌体可以将药物运送至中枢神经系统

由于BBB 的存在降低了靶向治疗的给药效率，因此带药载体通过BBB 的能力成为胶质瘤治疗的关键之一。BBB 在低级别胶质瘤中功能处于正常状态，Ff 噬菌体可以通过BBB 并在鼻内给药时直接向中枢神经系统传送药物。同时Ff 噬菌体可以抑制胶质瘤的生长，这种活性是由通过鼻内途径附着在病毒上的脂多糖分子介导的。Tsedev 等[31]将P3 衣壳氯毒素与inho 环状单链DNA 基因包装系统融合后生产出长度为50 nm 的噬菌体颗粒，将患者来源的胶质瘤标本植入小鼠颅内进行培养后注入此噬菌体颗粒，该颗粒可以靶向小鼠颅内原位患者来源的胶质母细胞瘤肿瘤，提示此噬菌体颗粒具有较强BBB 穿透力及肿瘤特异性结合力，对于胶质瘤治疗也具有一定价值。对流增强传送（convection-enhanced delivery，CED）是近几年用于脑肿瘤化疗的新方法，同时也是将M13 噬菌体传送至颅内的有效办法，其在中枢神经系统中的渗透是一个活跃的轴突转运过程，因此Ff 噬菌体可以通过CED 将药物传送至中枢神经系统用于胶质瘤治疗，但其效果仍需通过大量临床试验证实。Ff 噬菌体可以在高级别胶质瘤患者的正常血管受到干扰的情况下跨越BBB。Przystal 等[32]将腺相关病毒基因组和M13 噬菌体外壳相结合形成混合AAV/M13 噬菌体作为治疗双重靶向的神经胶质瘤的载体，后续实验中发现重组载体靶向小鼠的颅内肿瘤，并在人的神经胶质瘤细胞中表达基因，提示该双重靶向载体在穿越BBB的同时也可以进入神经胶质瘤细胞内发挥作用，另因其特异性结合能力较强，将该重组噬菌体进行基因修饰后可能会发挥更强的治疗效果。其中PⅢ/PVⅡ噬菌体-基因组双显示系统可以携带两种不同的外源性肽通过BBB 后进入中枢神经系统与肿瘤组织特异性结合执行不同的生物学功能。尽管目前胶质瘤治疗药物对肿瘤细胞有抑制作用，但研究表明其对正常细胞也会产生细胞毒性，Ff 噬菌体具有抗肿瘤能力并且在鼻内、CED 或静脉注射时是无害的，将其作为载体可减少对于正常神经细胞的损害[33]。有研究已使用人体肿瘤组织从Ff 噬菌体展示库中获取相应配体，这具有更高的临床相关性，并且这对于人体是可以耐受的，同时对胶质瘤患者进行不同剂量Ff 噬菌体展示毒性谱库后获得肿瘤归位噬菌体抗体和可溶性单链抗体，发现这些抗体可与胶质瘤特异性结合，并在临床试验中应用纳米纤维形状的Ff 噬菌体作为新型传递载体可有效穿透BBB 致使阿尔茨海默病、帕金森病患者颅内蛋白失调，延缓了疾病进展[34]。此外，Ff 噬菌体在静脉注射和人体循环后仍具有活性且未发生不良反应，提示Ff 噬菌体展示技术可用于识别肿瘤特异性配体，同时开发出一种在患者体内选择Ff 噬菌体显示配体的方案。根据以上学者的研究可以在理论上认为Ff 噬菌体可应用于胶质瘤的靶向治疗，并通过生物标志物的特异性对胶质瘤患者进行管理，在靶向治疗前对治疗靶点进行分析后开发个性化治疗。

3 小结与展望

Ff 噬菌体展示技术是开发有效药物传送载体的有力方法，它为未来的个性化治疗奠定了基础。Ff 噬菌体在携带药物的同时可增加药物对于BBB/BBTB的渗透性，尽管目前对于Ff 噬菌体的分离及纯化还存在诸多问题，但由于其安全性高，并且可以通过基因技术在其蛋白质外壳上表达多种多肽，以附着靶向肽和抗体，并且其本身具有抗肿瘤能力，能与细胞毒性药物相结合，使其成为胶质瘤治疗的理想载体。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。