羧化不全骨钙素与雄性动物生殖关系研究进展

张新科，朱雪丹，陈云，刘松柏，王明明，李思琪，张守全*

(1. 华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心/广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东 广州 510642；2. 韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005)

骨骼是人类以及哺乳动物最大的器官之一，约占总重的15%。长期以来，骨骼的作用一直被认为仅仅是维持身体运动和保护内脏的器官，是一种静态的、孤立的器官[1]。近年来，对骨骼更深一步的研究表明了骨骼不再是一种相对静态的组织，而是一种动态的组织，具有多种内分泌功能，参与调控动物机体多个器官的新陈代谢。其中由成骨细胞分泌的骨钙素(osteocalcin，OCN)，又被称为骨γ-羧基谷氨酸蛋白，最早从鸡骨和牛骨中被分离出来，是一种在骨形成过程中产生的可分泌非胶原蛋白，部分储存在骨基质中。骨骼时刻进行着骨重塑过程，正常的骨骼之所以能够维持一定的骨量就是依赖于破骨细胞与成骨细胞之间的这种动态平衡。骨重塑的调控是复杂的，体内多种激素在骨重塑过程中发挥着不可替代的作用，这些激素都是维持骨骼完整性所必需的。然而，OCN不仅参与骨重塑，而且其活性形式羧化不全骨钙素(uOCN)在雄性动物生殖能力方面的调控也起着关键作用。

OCN是骨骼中含量最高的非胶原蛋白之一。研究表明，OCN含46～50个氨基酸不等，其中人类含有49个氨基酸，小鼠含有46个氨基酸[2]。OCN结构中包含3个谷氨酸残基，在γ-谷氨酰基羧化酶的催化下，依靠二氧化碳和维生素K作为主要辅助因子进行羧化[3-4]。由于被羧化了的OCN对羟基磷灰石晶体中的Ca2+更具有亲和力，因此成骨细胞分泌的大多数OCN都会被羧化后嵌入骨基质中，所以OCN被认为是骨形成和骨重塑的特异性标志物之一。在骨吸收的过程中，OCN会在骨吸收形成的特定酸性环境下进行脱羧反应，成为一种uOCN，这会降低其对骨的亲和力，从而使得uOCN会被释放进入到血液循环中，最后作用于全身多个器官[5-6]。研究发现，OCN主要是通过其代谢活性形式uOCN发挥多种内分泌功能，uOCN释放到血液循环后，主要通过与G蛋白偶联受体6a(Gprc6a)和G蛋白偶联受体158(Gpr158)结合发挥内分泌功能[7-8]。一方面，uOCN与Gprc6a结合后，胰岛B细胞敏感性升高，胰岛素分泌增加，在肌肉和脂肪等组织中促进葡萄糖稳态平衡，并促进睾丸间质细胞合成睾酮，调节雄性动物生殖能力；另一方面，uOCN可以穿过血脑屏障并积聚在脑干、丘脑和下丘脑中，与特定神经元中的Gpr158结合以影响各种神经递质合成和信号传导，从而在改善认知功能和提升运动协调能力等脑部生长发育过程中发挥着关键调控作用。

1 骨重塑与OCN

骨骼是体内一种代谢相当活跃的组织，在体内不断地被重塑，因此才能够维持机体正常生命活动所需的骨量。健康的哺乳动物之所以能够维持恒定的骨量和正常的运动主要就是通过骨重塑的机制不断进行自我更新来实现的[9-10]。骨重塑是一个终生的过程，参与骨重塑的两种主要细胞是破骨细胞和成骨细胞。其中，破骨细胞具有吸收旧骨组织的功能，成骨细胞具有形成新骨组织的作用。正常情况下，成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收以一种动态平衡的方式进行工作，这样才能保证在机体的整个生命过程中维持骨骼的健康和完整性[10-12]。如果这种动态平衡被打破就会导致骨骼疾病，最常见的是骨质疏松症，这是因为与骨形成的速度相比骨吸收的速度降低了[13]。另外，骨重塑还受到甲状旁腺激素、生长激素、性激素、糖皮质激素、前列腺素、骨化三醇、降钙素、骨形态发生蛋白等全身调节因子以及包括多种细胞因子和生长因子在内的局部调节因子共同调控[14]。在哺乳动物的青春期，性腺类固醇激素在动物的骨骼快速增长和维持骨量方面扮演着不可或缺的角色[15]。

在骨重塑的过程中，骨骼的旁分泌和内分泌功能也在时刻进行着。越来越多的研究发现，骨骼不仅仅是一个运动器官，也是一个具有多种内分泌功能的器官，它至少会分泌两种激素，成纤维细胞生长因子23(FGF23)和OCN[16-17]。其中，FGF23主要通过控制与骨骼健康密切相关的磷酸盐稳态来调节矿物质代谢，而OCN除了调节骨矿化外，还可调节体内多个靶器官，包括胰腺、肝脏、肌肉、脂肪、睾丸以及中枢和周围神经系统[18]。另外，研究发现，OCN是在特定的环境下成为未完全羧化的形式uOCN时，才会被释放到血液，继而在葡萄糖和能量代谢、雄性动物生殖能力和大脑生长发育中发挥重要调控作用[19]。

2 OCN与uOCN结构

为了更进一步理解OCN与其未完全羧化形式uOCN两者的功能，研究人员对两者的结构进行了分析。首先，OCN的本质是蛋白质，而蛋白质的功能是由其结构决定的，所以OCN与uOCN两种不同的结构导致了两者不同的功能。OCN的结构由3个多肽链组成，包括1条N-末端多肽链、1条C-末端多肽链和一条中心多肽链，其中C-末端多肽链包含有与羟基磷灰石晶体中的Ca2+结合的位点。以人为例，人体内的OCN先被合成为具有98个残基的OCN前体，其中包括1条含有23个残基的信号多肽链(在翻译过程中易位进入内质网后被切割)、含26个残基的前体多肽链(包括γ-谷氨酰基羧化酶的识别位点)和49个残基的成熟多肽链。经过翻译修饰后，大多数OCN被完全羧基化，含有3个谷氨酰胺残基，然后与羟基磷灰石晶体中的Ca2+结合沉积到骨细胞外基质中。进一步研究发现，OCN是由3个α-螺旋、2个β-折叠和a-β片组成，形成一个疏水核心和紧密的球状结构。螺旋α1(H1)和螺旋α2(H2)通过从Asn26到Cys29的a-β弯连接，形成“V”形排列，并由Cys23和Cys29之间的二硫键连接。螺旋α3(H3)排列对齐以平分H1和H2的“V”形，这3个α-螺旋形成了一个紧密的疏水核心和一个以H1为中心的带负电的表面，与羟基磷灰石晶体中Ca2+结合有关的3个谷氨酰胺残基都位于H1的同一表面[20]。但由于在特定环境中γ-谷氨酰基羧化酶脱羧或维生素K缺乏活性不足从而导致部分或全部的羧化位点未被修饰成谷氨酰胺残基，就成为了只含有0～2个谷氨酰基残基的uOCN[21]。正是由于uOCN在羧化过程中的比OCN少了谷氨酰胺残基结构，因此导致其不易于与羟基磷灰石晶体中的Ca2+结合，因而当其被释放到血液循环中时便能发挥其一系列的内分泌功能[22]。总的来说，OCN与uOCN在结构上的差异主要是羧化状态的不同，uOCN在结构上缺少一些谷氨酰胺残基从而降低与羟基磷灰石晶体中Ca2+结合的可能性，因此其可以在体内发挥一系列的内分泌功能。

3 uOCN在提升雄性动物生殖能力方面的功能

uOCN是一种内分泌激素，在调节能量代谢、雄性动物生殖能力和大脑发育等方面都发挥着十分重要的作用。其中，uOCN对雄性动物生殖能力的提升这一新功能的发现更进一步证明了骨骼是一个具有多种内分泌功能的器官。睾酮是一种类固醇激素，是雄性动物体内一种重要的雄性激素，也被称为睾丸激素，它主要由睾丸间质细胞合成并分泌，它有许多功能，例如生殖细胞的存活和精子的发生等。研究表明，睾酮具有支持生殖细胞成熟并防止其过早凋亡的功能，体内睾酮水平的下降提示雄性动物生殖器官异常或衰老[23]。雄性动物体内睾酮水平的平衡能够促进睾丸和附睾的正常分泌，维持精子健康的生成和发育，因此维持雄性动物体内一定的睾酮水平对雄性动物生殖能力的提升有一定帮助。

随着研究人员不断研究，uOCN作为一种新型雄性动物生殖能力的调节剂出现在研究者的视线中。2011年，为了探究uOCN对雄性动物生殖能力作用的具体表现，Oury等[19]研究表明，敲除了uOCN基因的雄性小鼠会出现生殖能力明显下降的表现，如精子数目减少，睾丸、附睾和精囊重量下降。此外，进一步对试验小鼠体内血清uOCN含量进行分析发现敲除了OCN基因的雄性小鼠血清中uOCN水平也显著降低，说明由成骨细胞分泌的uOCN可能通过某种机制影响了精子的生成，进而调节雄性动物生殖能力。近年来，uOCN作为雄性动物体内睾酮产生的调节剂的功能在人身上也得到了证明。其中一项研究表明，对比健康人群和骨骼疾病患者的体内uOCN水平和骨转换速率发现，其与体内睾酮循环水平呈显著相关性[24]。此外，Kirmani等[25]的研究也表明，男性青春期中期的血清uOCN水平和睾酮水平之间存在显著关联。在人类临床研究中发现，中年肥胖男性的体内血清总OCN水平与体内睾酮水平呈显著正相关[26]。经过进一步探究发现，uOCN通过作用于睾丸间质细胞显著提升了睾酮的分泌量，而成骨细胞的这种内分泌功能仅限于雄激素睾酮的产生，而不影响睾丸或卵巢分泌雌二醇和孕酮。此外，成骨细胞的条件培养基以及外源uOCN均可增加睾丸间质细胞中睾酮的合成分泌，但卵巢外植体分泌的雌二醇和孕酮水平似乎没有受到影响[19]。目前这些证据都表明了成骨细胞对生殖的内分泌功能仅对睾酮的合成分泌起作用。2014年，Oury等[27]研究又发现，睾丸间质细胞中的Gprc6a受体可以与uOCN进行结合，并向下游的转录效应因子提供相应的信号传递，以此来提升睾酮的合成速率。因此，雄性动物体内的uOCN水平与体内的睾酮水平是息息相关的，uOCN可以促进雄性动物体内睾酮的生成。众所周知，性腺对骨重塑具有调控作用，例如雌激素和睾酮对动物骨骼的不断更新生长以及骨量的维持都有相当重要的影响，但反过来关于从骨骼到性腺的“反向调节信号”却很少报道。骨骼也可反过来通过uOCN发挥其内分泌功能来影响雄性动物的生殖功能，这一发现为研究人员对uOCN功能的研究打开了一个崭新的思路。

4 uOCN提升雄性动物生殖能力的作用机制

4.1 uOCN与胰岛素之间相互调节促进睾酮产生

uOCN对雄性动物生殖能力的影响让研究者们对这一相关机制产生了兴趣，在对uOCN是如何通过促进睾丸间质细胞产生睾酮的一系列研究中，意外发现在成骨细胞中设法增强胰岛素信号也能提高雄性小鼠的生殖能力，这表明了成骨细胞中胰岛素信号靶向调节雄性动物生殖能力的可能性。后续一系列的研究也验证了这一观点，即破骨细胞的活性可以通过胰岛素刺激骨转换来增强，这样胰岛素充当OCN激活的媒介，继而提升了雄性动物的生殖能力，形成“胰岛素-骨-性激素-骨”的反馈环路，其中，OCN在该环路的运转过程中扮演着多系统靶向调控的角色[28]。这也表明破骨细胞骨吸收是通过增加OCN生物活性来提升正常雄性动物生殖能力。进一步研究其机制发现，OCN具有一种不同寻常的激活方式，即依靠成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用进行激活。成骨细胞产生并分泌OCN存储在细胞外骨基质(ECM)中，然后破骨细胞的活性在ECM中产生吸收腔，诱导低pH(4.5)的环境，通过促进其脱羧反应来生物激活OCN[29]。胰岛素信号不仅能够调节成骨细胞对OCN进行脱羧激活成uOCN，胰岛素信号还能抑制成骨细胞中编码骨保护素(OPG)的基因的表达，从而阻碍破骨细胞的分化[30]。G蛋白偶联受体Gprc6a作为介导睾酮合成的受体，它在睾丸间质细胞中表达后与uOCN结合之后，有利于促进环磷酸腺苷cAMP的产生，从而激活转录因子CREB(cAMP反应元件结合)，并使CREB与睾酮生物合成必需酶的基因启动子区域结合，增加睾酮生物合成必需酶的转录。因此，被激活的CREB可以对几种编码睾酮生物合成必需酶的转录表达进行调控进而调控睾酮的合成，例如StAR，Cyp11a，3β-HSD和cyp17。其中，类固醇急性调节蛋白(StAR)负责把胆固醇转运到启动类固醇生物合成的线粒体中，而Cyp11a负责编码胆固醇侧链裂解酶(P450scc)，该酶是催化反应第一步和限速步骤的关键酶，可以把胆固醇转化为孕烯醇酮，最后由3β-HSD和Cyp17负责编码将孕烯醇酮转化为睾酮过程中所必需的两种酶[31-33]。因此，胰岛素可以通过刺激成骨细胞与破骨细胞来促进OCN的产生，并通过脱羧使其中一部分成为uOCN进一步发挥刺激睾丸间质细胞产生分泌睾酮的作用。同时，OCN也扮演着骨代谢和能量代谢之间桥梁的角色，uOCN可以促进胰岛素的分泌[34]。有研究表明OCN可以改善由脂毒性诱导的胰岛β细胞型胰岛素分泌障碍[35]。OCN与胰岛素之间的这种相互调节作用也为以后的相关研究指明了方向。

4.2 uOCN通过维生素D调节途径介导睾酮产生

uOCN与维生素D的关联也对雄性生殖能力有一定的影响。研究发现，维生素D主要是通过其活性形式1，25(OH)2D3促进睾丸间质细胞合成释放睾酮，而1，25(OH)2D3缺乏与年轻雄性动物的睾酮/雌二醇比例较低有关[36]。另外，动物试验研究通过饲喂缺乏维生素D的饲粮，发现雄性小鼠的睾丸重量和精子质量都显著降低，睾丸生殖细胞受到抑制，血清睾酮水平降低[37]。维生素D属于类固醇激素，是骨矿化和体内钙磷代谢稳态的主要调节因子。其中，维生素D3是维生素D的一种主要形式。维生素D3进入体内后与维生素D结合蛋白结合先在肝脏经由25-羟化酶Cyp2r1转化为体内主要存在形式25(OH)D3，然后再经过肾脏由1α-羟化酶Cyp27b1转化为活性形式1α，25(OH)2D3到靶器官发挥作用。de Toni[38]及其同事发现，利用睾丸间质细胞系，在与Gprc6a结合后，uOCN可以调节Cyp2r1的表达，有利于促进维生素D的羟基化。Cyp2r1作为编码维生素D转化为其活性形式1，25(OH)2D3所必需的一个关键酶，这表明uOCN对睾丸生成睾酮功能的促进作用可能是通过调节维生素D调节途径介导的，这也为uOCN在睾丸中的调节作用增加了另一个新的维度[39]。

4.3 uOCN通过下丘脑-垂体-性腺轴促进睾酮产生

下丘脑是中枢神经系统(CNS)的重要组成部分，主要通过其在垂体前叶和自主神经系统上的活动来调节神经内分泌功能。目前，有研究发现uOCN通过其受体在CNS中的直接调节功能，包括其在大脑正常发育过程中以及在认知功能障碍和帕金森综合征等病理状况下的有益作用[40-42]。关于uOCN通过下丘脑-垂体-性腺轴对雄性动物生殖能力影响的研究，研究人员也有不同程度的发现。Pi等[43]在雄性小鼠体内观察到Gprc6a不仅在睾丸间质细胞中表达，而且还在下丘脑和垂体前叶中表达。Piaggi等[44]发现中枢OCN受体Gpr158也在下丘脑和垂体中大量表达。这说明uOCN也可能通过与下丘脑和垂体中的Gprc6a或其受体Gpr158结合从而促进睾酮的产生。此外，据相关研究报道，人类体内uOCN受体的功能丧失突变与由高促性腺激素引起的性腺功能减退症有关，这表明uOCN可能是正常垂体-性腺轴发挥其功能所必需的物质[45]。uOCN可以穿过血脑屏障与下丘脑和垂体中的相关受体结合，然后通过对促性腺激素释放激素(GnRH)神经元和γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的调节发挥作用[46]。众所周知，睾丸功能的调节通常归因于下丘脑-垂体-性腺轴。根据这种内分泌途径，下丘脑释放GnRH刺激腺垂体产生两种促性腺激素，即卵泡刺激素(FSH)和促黄体激素(LH)。随后，FSH和LH通过作用于睾丸分别刺激精子发生和睾酮的产生，而睾酮反过来又抑制GnRH和促性腺激素的释放，具有负反馈作用[47]。uOCN通过下丘脑-垂体-性腺轴对雄性动物生殖能力的调控是复杂的过程。LH是一种垂体激素，它是睾丸间质细胞合成睾酮的主要调节因子。有研究表明，uOCN可以调节GnRH和LH的分泌频率，从而调节睾酮的合成分泌[48]。uOCN与睾丸间质细胞中的Gprc6a结合后，可以促进环磷酸腺苷cAMP的产生，从而激活转录因子CREB(cAMP反应元件结合)，并使CREB与睾酮生物合成必需酶的基因启动子区域结合，增加睾酮生物合成必需酶的转录。因此，被激活的CREB可以对几种编码睾酮生物合成必需酶的转录表达进行调控进而调控睾酮的合成，例如StAR，Cyp11a，3β-HSD和cyp17。

5 结语

OCN不仅参与骨重塑，而且在多种生理过程中起着关键作用。OCN具有提升雄性动物生殖能力的作用，主要是通过其代谢活性形式uOCN来发挥作用。uOCN不易与羟基磷灰石晶体结合，可以被释放到血液循环到达靶器官。uOCN可以通过胰岛素信号增强、维生素D介导途径和下丘脑-垂体-性腺轴与其特定的受体结合促进睾酮产生。总之，uOCN对雄性动物生殖能力具有一定促进作用，但具体作用机制有待更深一步进行研究。