伪狂犬病病毒研究进展

刘运超，杨素珍，尚延丽，郝慧芳

(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

根据农业农村部2022年修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》(第573号公告)，伪狂犬病(pesudorabies)被列为三类动物疫病，属多种动物共患传染病。伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pesudorabies virus，PRV)感染引起的一种病毒性传染病，最早发现于1813年的美国牛群中，随后该病在全球范围内广泛传播[1]。我国于1947年首次在猫体内发现PRV，随后陆续在牛、猪等家畜中发现该病毒。1980年代初，PRV已经蔓延至我国18个地区，暴发PRV的猪场中新出生仔猪的发病率和死亡率达到70%～100%。1979年我国从匈牙利引进gE缺失疫苗株Bartha-K61，随着该疫苗的推广使用，我国PRV流行在80年代末得到有效的控制。同时，许多国家开始实施PRV清除计划，到2000年前后，全球主要生猪养殖国家如加拿大、美国、新西兰、荷兰、瑞典、法国和德国等已经实现了PRV在家养猪群的净化，但是在欧洲东南部、拉丁美洲、非洲和亚洲等地区伪狂犬病仍然是危害养猪业的主要疫病[2]。

2011年我国出现了PRV变异株，华北地区大部分猪场PRV-gE阳性率高于50%，部分地区甚至达到90%，部分育肥猪也出现了典型的神经症状甚至死亡[3]。研究显示，该PRV变异毒株在进化上属于基因Ⅱ型，而欧美等经典的PRV疫苗毒株属于基因Ⅰ型，二者之间存在着较大的遗传距离，这可能是造成Bartha-K61经典疫苗免疫保护力下降的主要原因[4]。PRV流行株糖蛋白gB、gE和gI等基因在野毒株和疫苗株之间的重组，增强了变异毒株的毒力[5]。临床上PRV经常与猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)等发生混合感染，使得PRV防控更加困难[6-7]。《农业农村部关于推进动物疫病净化工作的意见》(农牧发〔2021〕29号)提出以“种畜场为重点，扎实开展猪伪狂犬病等垂直传播性疫病净化”工作。本文从伪狂犬病临床特征出发，对该病病原的分子生物学特征、致病机制和疫苗的最新进展进行综述，以期为伪狂犬病的临床防控提供理论参考。

1 伪狂犬病的临床特征

猪是PRV的自然宿主，但不同日龄和性别的猪感染PRV的临床症状存在差异，母猪感染PRV出现流产、死胎或木乃伊胎；种猪精液质量下降，导致不育；育肥猪出现呼吸系统障碍和体重增长停滞；2周龄以下仔猪的感染死亡率可达100%[8]。2011年出现的PRV变异株的毒力显著增强，母猪、哺乳仔猪、保育猪等受到感染时都出现典型的伪狂犬症状甚至死亡；妊娠母猪主要表现为产死胎和流产；断奶仔猪感染后出现长期的、难以根除的腹泻和神经症状。伪狂犬病是多种动物共患传染病，除了猪，还能感染牛、羊、马、兔、浣熊、犬、小鼠、豚鼠、狐狸等多种哺乳动物，也可以感染一些灵长类动物如恒河猴、狨猴等[9-10]。大多数被感染的动物在发病后24～48 h内死亡，临床特征通常是头部和颈部出现严重瘙痒，并伴有自残等精神症状。猪是PRV的主要储存宿主，只有猪可以发生潜伏性感染。近年来，不断有PRV感染人的报道，2020年，中国科研人员首次从一名急性脑炎患者中分离出PRV毒株(hSD-1/2019，GenBank编号MT468550)，这为人类感染PRV提供了直接证据[11]。

2 PRV分子生物学特征

2.1 PRV分类与基因组结构

PRV学名猪疱疹病毒1型(Suidherpesvirus1)，属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒属(Varicellovirus)，目前仅存在一个血清型。PRV是有囊膜的双链DNA病毒，基因组约142～145 kb，具有长独特区域(unique long，UL)和短独特区域(unique short，US)，内部重复序列(internal repeat sequence)和末端重复序列(terminal repeat sequence)位于US的两端。PRV基因组包含了70个以上的开放阅读框(open reading frame，ORF)，可编码70～100种蛋白质。成熟的PRV粒子直径在150～180 nm，呈圆形或椭圆形结构，由囊膜、二十面体的衣壳和衣壳内包裹的双链DNA组成[12]。

成熟的PRV衣壳蛋白由150个六邻体蛋白和12个五邻体蛋白组装成T=16的二十面体晶格结构，直径125 nm。六邻体蛋白由VP5蛋白(UL19)和VP26蛋白(UL35)组成，形成衣壳的各个面和条棱。十二面体的顶点中有11个五聚体的VP5蛋白组成，而第12个顶点是由12个门静脉蛋白分子组成的柱状通道，该通道的主要功能是允许一个拷贝的PRV DNA通过，进入组装完成的病毒衣壳[13]。所有的六邻体和五邻体通过三聚体VP19C(UL38)/VP23(UL18)/VP23(UL18)连接在一起，形成完整的PRV病毒粒子[14]。

2.2 PRV主要糖蛋白

PRV糖蛋白位于囊膜上，已经鉴定的PRV糖蛋白有11种，其中gB(UL27)、gC(UL44)、gD(US6)与病毒的免疫学特征相关，gE(US8)、gM(UL10)、gK(UL53)与病毒毒力相关，gG(US4)、gL(UL1)、gH(UL22)、gI(US7)、gN(UL49.5)与病毒的膜融合和免疫逃逸相关[15]。

糖蛋白gB由UL27编码，主要功能是通过其融合环以胆固醇依赖的方式结合到细胞膜上，参与膜融合过程。研究表明，由于gB的突变导致PRV突变株JS-2012和Bartha-K61的免疫反应产生较大差异，使得经典的疫苗毒株保护力下降。gB蛋白由913个氨基酸组成，其中1～58为信号肽序列，在444位精氨酸和445位丝氨酸之间存在1个弗林蛋白酶酶切位点，成熟的gB蛋白被弗林蛋白酶切割成gBb和gBc 2个片段。研究表明，gB有6个N糖基化位点，在病毒入侵细胞和细胞融合的过程中起着关键作用[16]。

糖蛋白gB存在多个B细胞抗原表位和中和性表位，大部分gB抗原表位处于14个拓扑结构不同的结构域中，其中10个抗原域位于gB复合体的gBc上，4个抗原域位于gBb上，所有位于gBc上的表位均呈构象依赖性，而gBb上的表位均为线性表位。在自然感染的猪和免疫的小鼠中，gBc的构象依赖性表位在诱导PRV的体液免疫应答中具有重要作用[17]。有学者鉴定出一系列PRV-gB的小鼠单克隆抗体(mAbs)，可以有效地阻断PRV感染，在这些mAbs中，14个以补体依赖的方式阻断PRV的进入，但是mAb 1H1可以直接中和病毒，不依赖于补体。同时，该研究者在PRV-gB的晶体结构上绘制了这些抗原表位的分布，结果发现所有的补体依赖性中和抗体结合位点均位于gB冠区，相比之下，mAb 1H1识别的表位处于一个包含融合环的亚基底部，表明mAb 1H1可能通过干扰膜融合过程中和病毒感染。有研究显示，以昆虫细胞表达的重组gB蛋白为抗原制备疫苗，免疫BALB/c小鼠，首次免疫后28 d，小鼠中和抗体效价可达1∶23.25。该研究在小鼠二次免疫后7 d，采用5倍半数致死量(median lethal dose，LD50)的PRV流行毒株HeNLH/2017进行攻毒，免疫组小鼠存活率达到100%，未免疫组小鼠全部死亡，表明gB是一种很有潜力的亚单位疫苗候选靶标[18]。

糖蛋白gC由UL44基因编码，由479个氨基酸组成，包含22个氨基酸的信号肽(1～22 aa)，胞质区(23～472 aa)和跨膜区(473～479 aa)。研究表明，PRV gC在病毒对宿主细胞的稳定吸附中起到重要作用，在没有gC的情况下病毒的吸附效率明显降低，gC缺陷的毒株滴度比野生病毒低3～20倍。PRV病毒与细胞的吸附有两种方式：gC介导的快速吸附和不依赖gC的不稳定慢吸附，两种吸附方式都可以被mAb抑制[19]。研究显示，gC也是小鼠和猪的PRV特异性细胞毒T淋巴细胞的主要靶抗原，抗gC的mAb可以引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)从而清除病毒。

糖蛋白gD由US6基因编码，主要功能是在PRV入侵时与宿主受体结合，从而启动膜融合过程。gD的胞外区主要包含2个功能不同的分化结构域。其中，HSV-1 gD的N末端(1～260 aa)主要携带受体结合位点，而C末端(260～310 aa)是预融合结构域(pro-fusion domain，PFD)，gD结合受体以后，PFD的构象发生变化从而发出膜融合信号。有研究者采用杂交瘤细胞融合技术筛选到4株具有体外中和PRV感染活性的单克隆抗体，该单抗识别gD蛋白316QPAEPFP322表位[20]。Zhang等[18]以昆虫细胞表达的gD抗原和gB/gD混合抗原免疫仔猪，在免疫后7 d即可产生高滴度的中和抗体，免疫后3个月中和抗体效价仍然维持在1∶25以上；免疫后28 d，以106.6组织半数感染量剂量(tissue culture infective dose 50%，TCID50)的PRV流行毒株HeNLH/2017攻毒，结果显示gD和gB/gD免疫组仔猪未出现发烧、排毒、gE抗体转阳和病理损伤等症状。

糖蛋白gE由US8编码，由579个氨基酸组成，属于Ⅰ型糖蛋白，从功能上可以分为四部分：N端的信号肽、胞内区、跨膜区和胞外区。gE是重要的毒力基因，也是PRV毒力传播的重要媒介，缺失gE导致病毒对宿主的感染能力降低。gE含有2个潜在的酪氨酸内化基序，分别起始于478位和517位氨基酸，参与感染细胞与临近细胞的融合，促进病毒在细胞之间传播。gE不是病毒完成复制的必要蛋白，因此gE缺失毒株很早就被用于弱毒疫苗开发，同时gE可以作为一种抗体检测靶标用于区分疫苗株和野毒株感染[21]。

糖蛋白gM由UL10基因编码，长度为1 185 bp，由394个氨基酸组成，包括8个潜在跨膜区。研究表明gM和gN以二硫键的方式连接在一起组成异源二聚体，gM辅助gN在病毒中的定位。有研究利用CRISPR/Cas9技术分别敲除编码gM、TK等蛋白编码基因，然后在小鼠感染模型中评估这些突变对PRV致病性的影响。结果显示，敲除TK和gM蛋白编码基因之后，病毒的毒力明显下降，表明gM也是影响PRV毒力的重要蛋白，且gM蛋白缺失对PRV毒力的影响仅次于TK缺失株[22]。

糖蛋白gK由UL53基因编码，长度为942 bp，由313个氨基酸组成。成熟的gK分子量约为36 kDa，包含高甘露糖和N-连接聚糖复合物，是PRV进入胞内传播所必需的。gK是重要的毒力基因，gK缺失株的子代病毒感染滴度显著降低。

糖蛋白gG由US4基因编码，长度为1 497 bp，由498个氨基酸组成。gG是PRV感染的细胞上清液中含量最丰富的病毒蛋白，可以和趋化因子以很高的亲和力结合。gG与趋化因子结合抑制了趋化因子介导的细胞迁移，gG基因缺失PRV毒株也丧失与趋化因子结合活性，表明gG参与了PRV的免疫逃逸。因此，gG虽然不是PRV的毒力基因，gG缺失毒株作为候选疫苗可以提升免疫原性[23]。

糖蛋白gH由UL22基因编码，长度为2 061 bp，由686个氨基酸组成。gH由N端胞外区和胞质尾部区域组成，是PRV诱导膜融合的关键糖蛋白，在入侵细胞以及病毒传播过程中起重要作用。研究表明gH和gL通常以异源二聚体的形式，直接结合gB从而激活gB的膜融合功能[24]。

糖蛋白gL由UL1基因编码，长度为471 bp，由156个氨基酸组成。gL与gH形成的异源二聚体，在PRV的感染过程中发挥重要作用，也是病毒在细胞之间传播所必需的。有研究显示，抗gL多抗血清可以中和PRV粒子的感染，但不能阻断PRV在细胞间的传播[25]。

糖蛋白gI由US7基因编码，长度为1 056 bp，由351个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜蛋白，有6个N-糖基化位点。研究表明gE和gI可以组成异源二聚体，该二聚体的主要功能是间接地促进或稳定US9和驱动蛋白家族成员1A(kinesin family member 1A，KIF1A)之间的相互作用。这3种膜蛋白是PRV病毒粒子在神经元有效顺行传播的关键蛋白。

糖蛋白gN由UL49.5基因编码，长度为297 bp，由98个氨基酸组成。gN由N端信号肽、C端胞质尾、内质网腔区和跨膜区组成。gN可以阻止病毒肽通过TAP转运从而阻断肽负载复合物将病毒肽转运到内质网，使得MHC I类分子无法在内质网膜上识别病毒多肽，进而逃避宿主天然免疫[26]。

3 PRV的致病机制

3.1 PRV的感染过程

PRV在呼吸道的复制受多种因素影响，如病毒接种途径、接种滴度、动物年龄和免疫状况等。PRV首先感染鼻腔、扁桃体和口咽等上呼吸道，主要在呼吸道上皮细胞复制，并在24 h内穿过基膜，以斑片状方式感染下层组织中的所有细胞类型(纤维细胞、内皮细胞、单核细胞)。在肺部，PRV在所有上皮细胞类型中复制，并向斑块方向扩散，肺巨噬细胞也被鉴定为感染的靶细胞[27]。在PRV感染后2～5 d，病毒以细胞传播的方式扩散到整个黏膜上，并深入黏膜下层。病毒复制诱导吞噬细胞在感染部位募集，吞噬细胞开始攻击感染区域，由此造成的大规模破坏会引起呼吸道症状，如打喷嚏、咳嗽、流鼻涕和呼吸障碍。在后续的入侵过程中，病毒在神经元、血液和淋巴管中传播，并到达大脑、淋巴组织和妊娠中的子宫等重要的靶器官。在PRV感染猪的2～7 d，可以检测到α干扰素(IFN-α)，且浓度与鼻内病毒载量成反比。感染后6～7 d，可以检测到体液免疫和局部细胞免疫，病毒粒子被中和抗体结合而失去感染活性，感染病毒的细胞被吞噬细胞清除。特异性免疫应答启动后，机体开始进入恢复阶段，在鼻腔接种后13 d和扁桃体接种后18 d能够完全消除PRV病毒粒子[28]。

3.2 PRV的入侵

PRV的潜伏期一般为3～6 d，短期有36 h，长期可以达到10 d。PRV主要是通过呼吸道感染，首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，经嗅神经、吞咽神经或三叉神经到达脑和脊髓，也可以通过鼻黏膜经呼吸道感染肺泡细胞。有囊膜的病毒通常依赖于细胞融合来完成感染，病毒穿过双层质膜把基因组DNA传递到胞内完成感染过程。在膜融合过程中，病毒囊膜与细胞质膜融合，从而使DNA基因组进入到宿主胞内。膜融合主要通过插入融合肽完成，与宿主细胞相互作用引发病毒膜表面蛋白质构象发生变化，导致囊膜上效应蛋白的一段多肽链进入靶细胞膜。病毒的融合肽通常埋藏在病毒粒子表面融合蛋白的寡聚界面上，并在融合过程中通过蛋白构象变化暴露出来[17]。

3.3 PRV的膜融合

PRV囊膜与宿主的细胞膜或囊泡的融合是PRV进入易感细胞的关键环节，这个过程涉及到gB、gD、gH和gL等糖蛋白的参与。gD胞外区由两个结构和功能都不同的结构域组成，包括N端的受体结合域和C端的前融合结构域(PFD)，gD在结合受体以后，其构象产生变化使其C端的PFD显露出来，从而释放出膜融合信号，激活膜融合，最终由gB在gH和gL的帮助下完成膜融合过程[29]。gD是膜融合的启动者，gB为膜融合过程的直接执行者，gH和gL为膜融合过程的辅助者，4个蛋白缺一不可。研究表明gD结构中包含了类似于HSV-gD的由N-和C-末端延伸包裹的IgV样的典型折叠结构。虽然已经鉴定出几种受体，例如3-O-磺化-乙酰肝素(3-O-S-HS)，疱疹病毒进入介体A(HveA，也称为HVEM)，TNF受体相关蛋白和Nectin-1等。然而，只有猪源Nectin-1与人源Nectin-1具有类似的结合gD的亲和力，且都参与了gD介导的细胞融合。同时，PRV-gD/SW-Nectin-1的复合结构表明：受体Nectin-1上的K61、T63、Q64、K75、Q76、N77、I80、N82、M85、S88、L90、A91、E125、A127、T128、F129、P130、N133和E135等氨基酸是Nectin-1和gD结合的关键位点，而这些氨基酸在许多物种的Nectin-1受体上(猪、人、鼠、牛、羊、山羊、猫、犬和蝙蝠)都是十分保守的。这表明PRV存在与这些物种的Nectin-1受体结合并且利用其完成细胞的入侵的可能性，提示PRV存在跨物种感染的风险[30]。因此，通过阻断gD介导的病毒囊膜与细胞膜融合，进而实现对PRV感染过程的阻断，对开发抗PRV特效药物具有重要价值。

3.4 PRV的细胞传播

疱疹病毒通过感染细胞病灶实现在体内和体外的传播，这种传播方式逃避了抗体、补体、酶以及吞噬细胞的病毒清除作用。这种传播方式主要有4种机制[31]：第一种情况是，PRV从已经感染的细胞直接传播到临近的未感染细胞，这一过程由表达在感染细胞膜上的病毒糖蛋白及未感染细胞的质膜上的受体介导；第二种情况是，被PRV侵染的悬浮液里的单个细胞或细胞团能够在其表面表达PRV包膜蛋白，通过这些蛋白附着并与未感染的邻近细胞融合，这一过程的机制与病毒细胞的附着和融合非常相似；第三种情况是，PRV病毒诱导的突起形成后，可能向较远处细胞而非临近的细胞传播，这一过程涉及到细胞和病毒成分之间复杂的相互作用，具体机制目前还不清楚，推测该过程可能与PRV感染引起的肌动蛋白重组，应力纤维分解，并形变成为不同的细胞突起，与邻近细胞接触有关；第四种情况是，PRV在细胞黏附分子介导的附着作用下与远处的细胞发生细胞间传播。PRV感染的单核细胞暴露于病毒特异性抗体后，会将其病毒糖蛋白与它们对应的MHC I类分子一起内化，使感染细胞无法被免疫系统的不同成分有效识别和消除。这些免疫掩蔽的单核细胞使用黏附分子wCD11R3和CD18特异性黏附内皮细胞，随后是病毒介导的膜融合过程，导致PRV向内皮细胞扩散[32-33]。有研究显示，以15 mg/kg剂量接种PRV中和性单克隆抗体10B6，可以抵抗致死剂量的PRV感染。进一步的研究结果显示，10B6可以抑制PRV-gD与细胞膜上的Nectin-1结合，进而抑制PRV对易感细胞的吸附，阻断病毒在细胞间的传播，表明Nectin-1也在PRV的细胞传播中发挥重要作用[20]。

4 PRV疫苗研究

接种疫苗是防控PRV感染的唯一有效手段。根据《国家兽药基础数据库》(http://www.ivdc.org.cn/xxgk/syzwglpt/)统计，2003年至今共有8个PRV疫苗获得新兽药注册审批，其中弱毒疫苗5个，灭活疫苗3个。2013年至今，共有41个PRV疫苗获得临床试验审批，其中有21个弱毒/基因缺失疫苗，16个灭活疫苗和4个亚单位疫苗。基因缺失疫苗与相应的鉴别诊断试剂盒联合应用，为伪狂犬病的预防、控制和净化提供了强有力的技术支撑。

我国在20世纪70年代末由哈尔滨兽医研究所从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株，为我国PRV感染的防控做出了重要贡献[34]。2011年，国内出现了PRV变异株，Bratha-K61株的免疫保护率下降，国内多个研究团队迅速开发了针对变异株的基因缺失疫苗[35]。有学者报道了针对PRV变异株的基因缺失疫苗PRV-TJ-ΔgE，在猪上可以保护105TCID50PRV-TJ野毒株感染[36-37]。随后有研究报道，基因缺失疫苗HN1201-ΔTK/gE/gI在猪上可以保护107TCID50的HN1201毒株的感染[38-39]；基因缺失疫苗RSMX-ΔTK/gE/gI可以保护107TCID50SMX毒株的感染[40-41]；基因缺失疫苗JS-2012-ΔgE/gI不仅可以保护105TCID50PRV JS-2012毒株的感染，同时可以保护105TCID50的经典毒株SC的感染[42]。也有研究显示，经典的Bartha-k61疫苗在加强接种剂量后可以保护生长中的猪免受PRV变异株的感染[43-44]。随着针对变异株的PRV疫苗陆续上市，疫情得到有效控制。目前，基因缺失弱毒疫苗仍然是临床防控PRV的主要手段。

灭活疫苗和亚单位疫苗具有更好的生物安全性和更长的免疫持续期，降低了疫苗的免疫频率，减轻了养殖企业的免疫压力，是PRV疫苗研究的热点[45-46]。目前，已经获得新兽药注册审批的PRV灭活疫苗主要有中国农科院上海兽医研究所研发的JS-2012-ΔgI/gE株基因缺失灭活疫苗和华中农业大学研发的HNX-12株gE基因缺失灭活疫苗。PRV亚单位疫苗主要是以重组表达的PRV糖蛋白gB、gC和gD为抗原，配合佐剂制备而成的疫苗[47-48]。目前，尚无PRV亚单位疫苗获得新兽药注册审批，但是仅2022年就有3个PRV亚单位疫苗进入临床试验阶段，可见该技术路线的高热度和认可度。不同技术路线的PRV疫苗具有各自的优势，弱毒疫苗免疫起效更快，灭活疫苗和亚单位疫苗则具有更长的免疫持续期，序贯免疫或许会成为PRV疫苗接种的有效方式。

5 总结与展望

伪狂犬病是一种由口、鼻传播的病毒性传染病，能够感染各年龄段猪，导致猪的生长停滞、繁殖失败和仔猪死亡。目前已经鉴定的PRV糖蛋白有11种，在介导病毒与细胞膜融合、病毒在神经元中的传导和免疫逃逸方面发挥重要作用。PRV的感染首先发生在上呼吸道，经膜融合进入呼吸道上皮细胞，随后沿神经元进行传导或者直接进入肺泡进行复制。近些年来，国内PRV流行株gE基因缺失疫苗和配套诊断试剂的研发，为稳定猪伪狂犬病防控和促进生猪养殖业健康生产发挥重要作用。然而，我国生猪养殖体量大，养殖情况复杂多样，管理水平参差不齐，加之PRV能够感染多种动物，彻底净化PRV任重道远。因此，在加强免疫与临床检测、促进PRV无疫区建设的同时，应积极开展PRV致病机制研究，为PRV临床净化工作提供理论指导和技术支撑。