间充质干细胞及其外泌体在药物性肝损伤治疗中的作用

邢国静， 罗龙龙， 王丽菲， 王顺娜， 郑晓凤， 卢利霞 ，张久聪

1 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化内科， 兰州 730050

2 宁夏医科大学总医院消化内科， 银川 750001

3 兰州大学第二医院消化内科， 兰州 730030

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是指由化学药品、生物制品、中成药等按处方药或非处方药管理的药品，以及中药材、天然药物、保健品、膳食补充剂等产品，或其代谢产物乃至其辅料、污染物、杂质等所导致的肝损伤［1］，是常见的药物不良反应，可在短期内造成肝衰竭，甚至死亡。据估计，我国DILI的年发生率至少为23.8/10万，高于其他国家［2］。N-乙酰半胱氨酸、糖皮质激素、水飞蓟素等药物虽然对DILI有一定治疗作用，但疗效和安全性有一定局限性［3-5］。人工肝作为一种临时肝支持系统，因其设备复杂、体积大，限制了其应用［6］。肝移植是目前唯一有效手段，由于器官供体短缺、免疫排斥反应和医疗费用高限制了其应用。近年来，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）在DILI治疗中的潜在优势逐渐突显，越来越多的研究表明，MSC可通过其归巢能力、肝源分化、免疫调节和旁分泌效应促进肝细胞再生及减少肝细胞凋亡，从而减轻肝损伤［3］。MSC来源的外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有类似MSC的功能，不仅无致瘤风险，且具有更低的免疫原性、较长的循环半衰期、良好的渗透性和生物相容性［7］，在肝损伤的治疗中颇受关注。因此，本文将从MSC和MSC-EXO的作用及干预DILI的作用机制进行综述，以期为DILI的诊治提供新的思路。

1 MSC及其外泌体概述

1.1 MSC概述 MSC是一种具有纺锤状结构和塑性底物黏附特性的非造血干细胞，具有强大的自我更新能力，可分化为中胚层谱系细胞和其他外胚层谱系细胞［8］。目前，已从脐带、月经血、脂肪、骨髓等组织中分离出MSC，临床常用的主要来源为骨髓、脐带血和脂肪组织。MSC表达表面标志物CD73、CD90和CD105，但不表达造血标志物CD45、CD34、CD14和CD79［9］。MSC具有多种生物学作用，如多谱系分化、免疫调节、血管生成、抗凋亡、抗纤维化活性和组织修复［10-11］；此外，还释放多种生物活性成分（包括蛋白质、生长因子、趋化因子、微小RNA（microRNA，miRNA）和细胞因子），参与组织修复及再生［12］。MSC如此强大的功能被认为是细胞治疗中最有前途的干细胞类型之一，已在肌肉骨骼系统、神经系统、心肌、肝脏、角膜、气管和皮肤等相关组织得到广泛研究和应用［13］。

1.2 外泌体概述 外泌体是直径为40～160 nm的细胞外囊泡，存在各种体液中并且可由多种细胞分泌；其携带大量生物活性物质，如DNA、mRNA、非编码RNA、脂质和各种蛋白质，不仅在细胞间物质转运和信号转导中起着重要作用，还在各种病理生理条件下作为诊断性的生物标志物和治疗载体，具有巨大的潜力［14］。此外，外泌体还含有大量的膜联蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81和CD9）和热休克蛋白（如Hsp60、Hsp70和Hsp90）［15］。早期研究表明，外泌体在炎症、细胞凋亡、凝血、细胞内信号传导、抗原呈递和细胞稳态等多种生物活动中起着至关重要的作用［16］。MSC-EXO作为MSC旁分泌作用的关键成分，不仅含有细胞因子、生长因子、信号脂质、mRNA和调节性miRNA，还表达血管内皮生长因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂和基质金属蛋白酶9，这些因子在血管生成和组织修复中发挥重要作用［17］。MSC-EXO作为一种新型的无细胞疗法，已被应用于各种疾病模型中，包括神经、心血管、免疫、肾脏、肌肉骨骼、肝脏、呼吸系统、眼部和皮肤疾病以及癌症［18］。

2 MSC及其外泌体移植治疗DILI的作用机制

2.1 减轻肝脏炎症反应 肝细胞作为肝实质细胞的重要组成部分，生理功能独特、所处环境特殊，极易在各种药物作用下受到侵袭而发生炎症反应。因此，有效减轻肝脏炎症反应被认为是缓解肝损伤的重要措施。

在对乙酰氨基酚（APAP）引起的肝损伤模型中，损伤的肝组织可分泌多种细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、单核细胞化学引诱蛋白-1、生长调节蛋白、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子-β1、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1等，这些细胞因子可有效诱导MSC迁移到受损肝脏部位，促进受损组织修复［19］。Salomone等［20］给APAP诱导的肝损伤大鼠移植脂肪组织MSC，发现其可使血浆ALT和AST表达下调、凝血酶原时间减少、血氨水平正常；HE染色显示肝组织坏死也被完全抑制。人脐带MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）给药不仅可以改善APAP诱导的肝损伤小鼠血清ALT水平、病理损伤；还可抑制肝脏促炎细胞因子和趋化因子［包括TNF-α，IL-1β，单核细胞趋化蛋白-1和趋化因子（CXC基序）配体1］mRNA水平，并减少巨噬细胞、中性粒细胞向肝组织浸润。特别是Notch激活的hUC-MSC，可大大增强上述抗炎活性和治疗作用［21］。

MSC-EXO是一种重要的旁分泌效应体，在组织、器官损伤修复过程中可有效降低肝脏炎症反应，避免肝组织进一步损伤、恶化。在D-氨基半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）诱导的小鼠肝损伤模型中，脂肪组织MSC-EXO可通过抑制miR-17介导的硫氧还蛋白互作蛋白减少肝巨噬细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的活化来改善肝脏炎症反应［22］。此外，在TNF-α预处理后，hUC-MSC释放大量富含miR-299-3p的外泌体，可通过抑制NLRP3通路的激活来减轻炎症并促进肝组织修复［23］。由此可见，除了MSC和MSC-EXO在减轻肝脏炎症反应，维持肝脏稳态方面发挥重要作用；外泌体相关非编码RNA也在肝脏保护作用方面发挥重要作用，为肝损伤的治疗提供了新的方向和依据。

2.2 促进肝细胞增殖及再生 肝脏损伤后，肝细胞增殖及再生是肝脏从损伤中恢复所依赖的一个重要过程，在肝细胞存活和肝稳态中起着至关重要的作用，也是治疗DILI的重要途径。MSC迁移至受损肝脏后发生肝源分化，并释放生长因子，如肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-6、纤维蛋白原和转化生长因子-α等促进肝细胞增殖及再生［24］。在胺碘酮诱导的体内外肝损伤模型中，脂肪组织MSC不仅可以增加损伤肝细胞的细胞活力、阻止细胞凋亡途径的激活、刺激启动期基因的表达，还可使免疫细胞浸润减少及再生反应增强，显著减弱小鼠肝损伤［25］。

MSC-EXO也可有效促进肝细胞增殖及再生，阻止DILI的进展。在采用APAP和H2O2诱导的体外肝细胞损伤模型和CCl4诱导急性肝损伤的小鼠模型中观察到，人类胚胎MSC-EXO干预后，启动期因子表达增加、细胞活力得到改善、肝脏再生基因［核因子（NF）-κB、cyclin D1和cyclin E］和细胞增殖标志物（增殖细胞核抗原）的表达明显上调［26］。因此，不管是体内还是体外实验，MSC及MSC-EXO均可改善受损肝脏，并刺激剩余的肝细胞再生和恢复，延缓疾病进展。

2.3 抗肝细胞凋亡作用 细胞凋亡是一种高度调控的细胞死亡形式，是许多稳态和病理所必需的流程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控。Liu等［27］证实hUC-MSC移植可使D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色阳性细胞减少、Bcl-xl/Bax蛋白比率增加、裂解半胱天冬酶-3和TNF-α水平下调。

自噬是由溶酶体介导的细胞分解代谢过程，在维持肝细胞和代谢稳态方面起着重要作用。骨髓MSC-EXO通过增加自噬标记蛋白（微管相关蛋白轻链3-Ⅱ、Beclin-1）的表达促进自噬体的形成，在自噬体的诱导下促凋亡蛋白Bax和裂解半胱天冬酶-3的表达水平显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平上调，显著减轻D-GaIN/LPS诱导的肝细胞损伤和凋亡，提高存活率［28］。另有研究［29］发现，hUCMSC-EXO可通过激活胰岛素样生长因子-1/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号通路，进而逆转APAP诱导的肝细胞凋亡。近些年，关于MSC及MSC-EXO的研究尚处于起步阶段，其抗凋亡所涉及的信号通路仍需进一步研究。

2.4 改善氧化应激 氧化应激是多种肝脏疾病常见的病理生理基础，氧化应激与抗氧化应激失衡即可影响DILI的进展。越来越多的证据表明MSC和MSC-EXO在治疗肝损伤过程中可通过降低氧化应激发挥其治疗作用。Huang等［30］证实小鼠视网膜脂肪组织MSC可抑制细胞色素P450活性、减少毒性硝基酪氨酸的积累、增加抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶）活性及抗氧化因子（核因子红细胞2相关因子2、血红素氧合酶1、醌氧化还原酶1）基因的表达来保护肝细胞免受APAP诱导的细胞损伤。深入研究发现这与下游MAPK信号激活被抑制和炎性细胞因子（IL-1α、IL-1β）的产生密切相关。另有研究［31］证实hUC-MSC条件培养基可通过下调miR-486-5p和上调丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白Pim-1减轻H2O2诱导的肝细胞氧化应激损伤，其机制与抑制TGF-β/Smad通路有关。

越来越多的研究表明MSC-EXO可减轻损伤肝细胞的氧化应激状态，逆转氧化应激诱导的细胞凋亡。研究人员［32］在CCl4诱导的小鼠肝损伤中比较了hUC-MSCEXO与保肝剂（联芬双酯）的抗氧化作用，结果显示，hUCMSC-EXO具有更明显的抗氧化和保肝作用。更重要的是，hUC-MSC-Ex可通过调节多条信号通路改善氧化应激，如在CCl4和H2O2诱导的肝损伤模型中，hUC-MSC-Ex可通过上调ERK1/2和Bcl-2及下调IκB激酶B/NF-κB/胱天蛋白酶-9/-3途径，并输送谷胱甘肽过氧化物酶1以改善氧化应激诱导的细胞凋亡［33］。

2.5 免疫调节作用 免疫失衡是肝损伤重要的发病机制。在炎症组织部位，MSC可以直接影响先天和适应性免疫细胞的浸润和活性，诱导肝组织修复和再生。一项刀豆球蛋白A诱导的急性肝损伤小鼠模型的研究［34］表明，扁桃体MSC通过抑制淋巴细胞、树突状细胞和Kupffer细胞的浸润，降低损伤小鼠血清炎症因子（TNF-α、TNF-γ和IL-4）水平，并增加肝保护因子IL-10的血清水平。Wang等［35］证实骨髓MSC分泌的前列腺素E2可诱导巨噬细胞从M1（促炎）向M2（抗炎）表型极化，减少促炎因子的释放，抑制D-GaIN/LPS诱导的肝脏炎症反应和肝细胞凋亡。骨髓MSC还可通过下调肝脏自然杀伤T淋巴细胞中的IL-17及增加产生IL-10的调节性自然杀伤T淋巴细胞数量减弱CCl4诱导的急性肝衰竭［36］。此外，MSC还可通过抑制中性粒细胞的募集和活性，改善D-GalN/LPS诱导的大鼠肝功能，降低病死率［37］。MSC对适应性免疫细胞（如T淋巴细胞或B淋巴细胞）的增殖和活化作用也被研究所证实［38］。

MSC-EXO也参与DILI的免疫调节，研究发现IL-6预处理可显著上调hUC-MSC-EXO中miR-455-3p的水平，这些外泌体通过下调靶基因PIK3r1，抑制巨噬细胞活化。在小鼠内毒素血症和化学性肝损伤模型中，过表达miR-455-3p可减轻肝损伤、减少巨噬细胞浸润及血清炎症因子水平，改善肝损伤［39］。小鼠骨髓MSC-EXO可通过减弱Kupffer细胞M1型极化，减轻肝脏炎症反应，促进CCl4诱导的体内外肝组织修复［40］。由此可见，MSC和MSCEXO均可通过免疫调节作用，有效抑制促炎免疫细胞的活化及促炎细胞因子分泌，阻断免疫反应的级联活性，恢复肝脏免疫稳态。

3 MSC-EXO移植治疗其他肝脏疾病的作用机制

MSC-EXO除了在DILI中具有保护作用，在其他肝病中也发挥重要作用。如在CCl4诱导的肝纤维化小鼠中，hUC-MSC-EXO通过递送miR-148a靶向巨噬细胞中的Kruppel样因子6/信号转录和转录激活因子3途径发挥抗纤维化作用［41］。在非酒精性脂肪性肝炎动物和细胞模型中，hUC-MSC-EXO被证实可通过减少细胞脂质沉积，减轻肝损伤［42］。在缺血/再灌注肝损伤模型中，人诱导多能干细胞来源MSC-EXO通过抑制炎症细胞的浸润、减少炎症因子的释放、改善氧化应激，减轻肝细胞坏死和凋亡［43］。近年来，MSC-EXO对肿瘤的作用一直是研究热点，其在肝癌治疗中展现出“双刃剑”作用，一方面可抑制肿瘤生长，另一方面也可促进肿瘤的生长和迁移［44］。

4 MSC及其外泌体在疾病治疗中的局限与挑战

如上所述，MSC移植在体内外实验中均可有效减轻肝损伤，但研究［45］表明，MSC在受损组织区域的存活率低，移植潜力低和潜在的致瘤性也限制了其在组织修复中的有效性。此外，MSC在接受体外预处理（如化学试剂、缺氧或炎症）后可增加疗效，但这些因素的适用剂量及是否会对MSC产生不利影响尚不清楚［46］。MSC-EXO在疾病的治疗中显示出良好的应用前景，但也存在很多挑战：（1）尚无统一的分离、纯化技术来获得外泌体；（2）分离的外泌体其储存以及运输条件的系统标准和方案尚未建立；（3）外泌体注射的最佳剂量和注射频率尚不确定；（4）外泌体来源多样、成分复杂，目前尚无法确定改善DILI的具体物质；（5）大多数研究都是短期的，长期治疗效果未知。综上，虽然MSC-EXO在再生医学方面理论上优于MSC，但仍需要更多的临床前实验和基础研究来克服外泌体在治疗应用中的局限性。

图1 MSC及MSC-EXO移植治疗DILI的作用机制Figure 1 The mechanism of MSC and MSC-EXO transplantation in the treatment of DILI

5 小结与展望

MSC-EXO作为无细胞疗法，为DILI提供了一类有效的治疗方法，为改善肝损伤、逆转肝衰竭和改善预后提供了新的方向。尽管临床前研究中的绝大多数阳性结果尚未转化为临床疗效，相信随着相关技术的日益成熟，MSC-EXO背后分子机制不断深入研究，MSC-EXO的治疗潜力可以得到充分发挥。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：邢国静负责课题设计，撰写论文；王丽菲、罗龙龙、王顺娜、郑晓凤参与修改论文；卢利霞、张久聪负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。