丝素蛋白作为口腔组织再生屏障材料的应用进展

郑雨欣,丁榆德,陈 枫,杨 帆

引导组织再生(guided tissue regeneration,GTR)在1976年由Melcher第一次提出,是一种能有效促进牙周附着再生的技术[1]。在此基础上,Buser等[2]于1993年又进一步提出了引导骨再生(guided bone regeneration,GBR),从此开启了种植骨再生领域的新篇章。在引导牙周组织或骨组织再生的过程中,屏障膜作为再生过程的必要条件之一,是目前研究的热点。其中丝素蛋白(silk fibroin,SF)具有良好的生物相容性、优异的强度和韧性以及可调节的降解率,备受关注[3-4]。

本文对丝素蛋白作为屏障材料在口腔组织再生方面的国内外文献作一综述,探讨丝素蛋白屏障材料在GTR/GBR中的研究现状及前景。

1 GTR与GBR屏障膜

1.1 GTR

牙周炎作为临床上最常见、最具破坏力的口腔疾病,最主要表现为牙周支持组织的丧失[5]。而GTR作为牙周组织再生的重要手段,是目前治疗牙周炎的主要方式之一[6]。GTR治疗主要使用屏障膜选择性地引导目标细胞增殖,阻止封闭环境外的牙龈上皮和结缔组织的长入,有利于牙周膜细胞迁移到牙周缺损部位,促进新的组织和骨的形成,形成新的附着[7]。显然,其中屏障膜的选择和应用是牙周再生的关键。因此,选择和研发合适特性的屏障膜材料在牙周再生中尤为重要。

1.2 GBR

种植牙自1965年Brånemark教授首次实施以来,已成为口腔医师修复缺失牙的首选[8]。其中,充足的骨量是种植成功的关键。但研究统计显示,上前牙区常见牙槽骨骨量不足或骨质欠佳,约90%患者存在颊侧骨壁缺失或变薄的现象,需要在种植手术前施行骨增量手术[9-10]。

GBR作为临床治疗上应用最广泛的骨增量术式,其基本原理与GTR类似,通过屏障膜形成一个封闭环境,阻止该区域外的成纤维细胞及上皮细胞长入,保证负责骨重建的成骨细胞、破骨细胞优先定植,从而实现骨组织再生[11]。而对具有阻挡目标细胞、维持成骨空间作用的屏障膜的研究,目前已成为GBR发展的关键之一。

1.3 屏障膜

目前国内外各学者普遍认可GBR/GTR中屏障膜的必要性,临床最常用的屏障膜主要分为不可吸收膜和可吸收膜[12-13]。

不可吸收膜包括:膨胀型聚四氟乙烯膜(expanded-polytetrafluoroethylene,e-PTEF)以及钛增强的聚四氟乙烯膜等[14-15],具有强度大、可个性化塑形等优点,适合于缺损类型较严重的骨缺损区修复。但因为生物相容性差,早期易引起软组织并发症,暴露后容易感染导致成骨不佳甚至失败,且需要二次手术取出,限制了其进一步发展[16]。

可吸收膜包括牛、猪或者人的肌腱、真皮、皮肤、心包等天然来源的胶原膜以及聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)等人工合成的聚合物膜[17-21]。其中胶原膜因具有较好的生物相容性、能快速血管化、免疫原性低、无需二次手术取出等优点,目前已成为屏障膜的首选;但它也存在机械强度不足、降解速度快、空间维持能力差、屏障作用时间短等缺点,在治疗较严重的骨缺损区时,往往无法获得满意的临床效果[22]。

结合目前各类屏障膜的优缺点分析,优秀的屏障膜应具备以下特点:具有良好的生物相容性、组织整合性、细胞封闭性、维持空间性及临床可操作性等,研发合适的屏障膜材料已经成为GBR/GTR进一步发展的关键[23-24]。

2 丝素蛋白的结构

丝素蛋白是从蚕丝中提取的一种独特的天然蛋白,其主要来源为家蚕和柞蚕,由18种氨基酸组成,氨基酸序列由两个不同的亚基构成:一个轻链和一个重链,再通过一个二硫键相互连接,轻链由一个非重复的、亲水的序列组成,而重链的氨基酸序列由重复的Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser和Gly-Ala/Ser/Tyr二肽的重复段构成,形成了12个晶体结构域[25]。这种高甘氨酸含量使重链紧密堆积成非常稳定的β-sheet纳米晶体,并通过氢键相互作用,提升了丝素蛋白的力学性能[26]。

3 丝素蛋白的生物特性及在口腔再生屏障材料中的应用现状

丝素蛋白具有优良的生物相容性、生物降解性、生物可吸收性、低免疫原性和可调节的力学特性等优点,这也提示了丝素蛋白在组织再生领域的潜在用途[27-28]。

3.1 丝素蛋白屏障材料的生物相容性

生物相容性是屏障膜的基本要素,决定了细胞能否在屏障膜表面黏附、增殖和分化,以及后期人体对屏障膜是否会产生相应的抗原反应。

早在1993年,丝素蛋白的生物安全性与生物相容性就已经被美国食品和药物监督管理局(FDA)认可。丝素蛋白被广泛用于缝合材料[29-30],目前,FDA已经批准了不同的丝基医疗设备,如长期生物可吸收手术网片和丝素蛋白基韧带移植物SeriACLTM。此外,丝素蛋白还被研究制备成用于伤口敷料的生物材料,临床应用的产品也正在开发中(Akeso生物医学公司)[29,31]。

而作为屏障膜材料的研究,不论是体内还是体外研究,均发现丝素蛋白没有细胞毒性[32-34]。丝素蛋白在生物体内GBR过程中引起的炎症反应程度与目前临床最常应用的胶原膜相似,其具有良好的生物相容性。Kim等[35]在兔颅骨缺损模型中应用丝素蛋白纳米纤维膜并评估其对骨再生的影响,实验结果证实丝素蛋白纳米纤维膜仅有轻微炎症反应,具有良好的生物相容性和明显的骨再生效果。同时,Ha等[36]在显微镜下观察到丝素膜周围几乎没有炎症细胞,且在骨再生的区域有一个组织良好的血管网络,证实了血管生成是加速丝素膜帮助骨愈合的关键因素。实验结果显示,丝素膜能获得理想的GBR效果,且骨增量高度高于胶原膜和聚四氟乙烯膜。Smeets等[37]制备了一种羟基磷灰石、β-磷酸三钙改性后的丝素蛋白膜,通过兔颅骨缺损实验表明,与胶原膜相比,新型改性的丝素蛋白膜具有良好的生物相容性,在10周后更有利于支持骨形成,并能有效防止软组织的长入,起到屏障作用。Kim等[38]采用大鼠颅骨缺损模型证实了丝素蛋白膜与胶原膜相比没有任何更为严重的炎症反应,且获得了良好的骨增量效果。这些研究结果均已证明丝素蛋白膜具有良好的生物相容性,可以用作GBR的屏障材料之一。

3.2 丝素蛋白屏障材料的生物可降解性

生物可降解性和生物可吸收性是可吸收屏障膜材料的另一重要特征。理想的可吸收屏障膜材料需要在植入一段时间后,能被患者自身的细胞和细胞外基质逐渐取代。同时,要确保生物降解的副产物是无毒的,在体内代谢时不会干扰其他组织、器官和功能。根据GBR或GTR目标组织的不同,理想的屏障膜需要以可控的速率降解,能提供足够的屏障时间支持组织再生。因此,控制降解速率是可吸收屏障膜材料研究的主要目标之一。

丝素蛋白作为一种酶降解聚合物,已被证明不会引起免疫原性反应,可以在体外或体内被各种酶(如α-糜蛋白酶、蛋白酶ⅩⅣ和胶原酶ⅠA酶等)降解,其降解产物主要是氨基酸和肽,降解后在体内容易被吸收,生物医学应用潜力巨大[39-40]。

通过对丝素蛋白在生物体内的降解速率研究,学者们发现其中降解速率可调的关键在于其二级β-sheet结构的增减。Wang等[41]在Lewis大鼠中植入丝素蛋白多孔支架后,发现该支架在巨噬细胞的作用下8周开始降解,1年左右完全降解消失。但天然蚕丝纤维的降解速度就相对要慢得多,进一步研究发现,这是因为天然蚕丝纤维的β-sheet二级结构含量明显高于丝素蛋白[42]。研究表明,丝素蛋白的降解受水不溶性silk-Ⅱ和水溶性silk-Ⅰ结构含量的影响,随着silk-Ⅱ数量的增加,β-sheet结构量的增加,降解时间也增加。通过对β-sheet结构量的增减,可以调控丝素蛋白降解速率至目标材料所需的范围[43-44]。例如,丝素蛋白薄膜通过乙醇处理,将水溶性silk-Ⅰ转变为水不溶性silk-Ⅱ结构,从而增加了更多的β-sheet结构,降解速率减慢[4]。相反,丝素蛋白薄膜通过缓慢的空气干燥过程只含有较少的β-sheet结构,降解速率就会大大加快。此外,超声治疗也被证明可以将silk-Ⅱ转化为silk-Ⅰ,从而促进丝素蛋白的降解[45]。同时,也有研究表明,将蛋白酶抑制剂整合到丝素蛋白基体系中,使得蛋白酶酶促降解反应被抑制,可以大大降低丝素蛋白的降解速率[46]。这种增强的降解调控也为丝素蛋白在控制药物释放的应用开辟了新的可能性。

而在丝素蛋白作为屏障材料的降解研究中,各学者也做了不同的尝试。Geão等[47]对丝素蛋白膜的降解深入研究,通过热退火法制备出具有高延展性的丝素蛋白/甘油混合膜,并将其与人牙周膜成纤维细胞一起培养7 d后,发现混合膜的降解能力优于纯丝素蛋白膜,并且具有较高的亲水性,能大大增强细胞的黏附和活力,有望应用于牙周再生。Ko等[48]应用CF4气体等离子处理获得了一种同时具有疏水性和亲水性的丝素蛋白膜,在有效阻挡软组织入侵和促进GBR的同时,历经5个月的生物降解后,仍未发生明显的收缩和变形,这为丝素蛋白作为GBR屏障材料提供了新的制备工艺参考。

3.3 丝素蛋白屏障材料的机械性能

在GTR或GBR中,屏障材料要求能够抵抗外界的压力,维持稳定的支撑空间,并且在临床操作时要具备一定的抗压缩拉伸能力,因此对材料具有较高的力学性能要求。丝素蛋白具有优异的力学性能,断裂应变率4%～26%,极限强度300～740 MPa,韧性70～78 MJ/m3,这为开发丝素蛋白基屏障材料提供了较大优势[49]。

尽管天然蚕丝具有优异的力学性能,但大多数由再生丝素蛋白溶液直接制备获得的材料都是弱而脆的,这主要是因为再生材料中缺乏适当的二级结构和层次结构[42]。因此,为了获得更好的力学性能,研究者尝试通过重组再生丝素蛋白的弱氢键,使丝素蛋白具有自组装和自修复的能力,自组装成更大的纤维结构,获得更优化的分子层次顺序和更优异的力学性能[26,43]。研究表明丝素蛋白的浓度、加工温度、甲醇/盐处理、水退火处理、孔径、3D生物打印技术等各种处理都会影响丝素蛋白的力学性能,我们可以通过改变影响因素来增强丝素蛋白的力学性能[49]。考虑到丝素蛋白生物材料强大的力学性能,研究人员已经将丝素蛋白应用作为承载组织再生的支架材料,特别是在肌肉骨骼组织的再生中[28]。

3.4 丝素蛋白屏障材料的药物传递作用

在口腔组织再生中,干细胞可以被招募并分化成成骨前细胞、前牙周膜细胞和成骨细胞是GTR的重要条件。其中,生长因子在调节干细胞的归巢和分化中至关重要。在GTR或GBR中,屏障膜通过释放生长因子调节干细胞从而提高组织增殖能力和骨再生能力。

由于其较慢的降解速率,丝素蛋白已被证明是生物活性药物传递的载体,特别是在骨再生领域[27,52]。为了模仿生理上的骨骼层次,研究者已经研究了各种形态的丝素蛋白,并应用于输送骨特异性生长因子,如骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、血小板生长因子、基因和酶等[53-54]。

丝素蛋白目前已被用于输送生物活性分子,特别是BMP-2,因为BMP-2在促进成骨方面起着关键作用。研究表明,负载BMP-2的丝素蛋白颗粒成功地诱导了大鼠异位骨的形成,随着BMP-2的传递速率增加,骨密度也随之增加,同时加载BMP-2的丝素蛋白组骨形成能力优于单独使用BMP-2组[55]。这强调了丝素蛋白作为一种有效的载体,在提高BMP-2作为药物传递分子促进骨再生的疗效方面具有不可或缺的作用。

为了促进成功的骨再生,有效的组织血管化也是一个重要条件。因此,除了BMP-2外,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨再生中起着至关重要的作用。研究发现,持续传递VEGF可以促进新生血管的形成和成骨细胞的分化来帮助GBR[56]。Farokhi等[57]制备了一种负载VEGF的冻干丝素蛋白/磷酸钙底物电纺丝聚(乳酸共乙醇酸)纳米纤维,VEGF在体外28 d测量的释放谱维持生物活性为83%,该传递系统在体外具有良好的细胞相容性,增强了成骨细胞的黏附、增殖和碱性磷酸酶活性。在兔颅骨缺损模型中诱导形成8 mm临界大小的新骨,获得了良好的骨再生效果。由于VEGF和BMP-2是参与血管生成和成骨的重要因素,也有学者将两者结合并包裹负载,体内实验结果表明,虽然BMP-2单独介导了骨形成,而VEGF触发了新生血管,但它们的相互作用促进了术后12周的成骨和成血管[58]。

在GTR研究中,Song等[59]通过静电纺丝法技术将明胶纳米球合并到丝素蛋白纳米纤维膜中,制备了一种不使用任何有机溶剂的新型纤维纳米给药系统。实验表明这种纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌具有良好且持久的抗菌作用,同时该膜能促进牙周膜细胞的附着、扩散和增殖,有望应用于牙周再生。

4 总结与展望

丝素蛋白是一种独特的兼具生物医学和力学特性的天然生物材料。与目前临床上使用的大多数生物可吸收膜相比,丝素蛋白材料生物相容性良好,且有可控的生物降解性,具有更好的组织愈合效果,在生物模型中显示出良好的骨再生效果。然而,通过传统方法制备得到的纯丝素蛋白膜的力学性能可能无法满足口腔生物膜的要求,这也阻碍了丝素蛋白作为屏障材料的应用。我们可以通过改进丝素蛋白的制备方法、结合其他材料优化性能、对丝素蛋白进行基因调控以及通过结合新型技术如3D生物打印来更好地克服这一缺点。例如,将丝素蛋白与其他材料如氧化锌纳米粒子、羟基磷灰石纳米粒子混合,以及应用静电纺丝的方法使丝素蛋白膜具有良好的力学性能和适宜的降解率,从而更适合GTR/GBR的临床应用。

目前丝素蛋白屏障材料仍处于不断探索和改进的过程中,需要更多的实验研究来验证丝素蛋白改性的成果。当然,在屏障膜中加入生长因子可能是丝素蛋白作为GTR/GBR屏障材料的另一种改进。但仍需要更多关于丝素蛋白膜载药的研究,同时探讨如何控制这些生物因子的释放,从而验证其在GTR/GBR中的实际效果。

目前关于丝素蛋白屏障材料的研究并不全面,仍需要大量的生物学、临床研究和进一步的改性研究来解决当前的问题。但是参考目前丝素蛋白的生物特性以及许多关于丝素蛋白屏障膜的基础实验,我们认为丝素蛋白是一个很有潜力的蛋白质基屏障材料,具有广泛的口腔组织再生应用前景。