Neurogenin1基因在神经发生中的作用机制及相关中医药治疗研究进展*

张琳琳 章 洁

1 天津中医药大学第二附属医院脑病针灸科,天津市 300250; 2 天津中医药大学

神经发生(neurogenesis)是指从神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、分化为神经元或神经胶质细胞,并逐渐向功能区域迁移、发生可塑性变化并与其他神经元建立突触联系从而产生神经功能完整的过程。在此过程中,多种内源性的信号分子参与并调控干细胞的增殖与分化。其中Neurogenin1基因(简称Ngn1),作为碱性螺旋—环—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)蛋白家族中的成员之一,能在神经前体细胞(neuronal precursors)中被强烈诱导表达,并调控神经前体细胞分化为神经元细胞,且抑制其向星形胶质细胞分化[1],为调控NSCs分化的重要因子,在神经发生过程中发挥着关键的作用,与神经系统多种疾病具有相关性,目前发现,可通过中医药手段对Neurogenin1基因的表达进行干预,从而对相关神经系统疾病起到一定的治疗作用,现将其总结如下。

1 Ngn1简介

Ngn1基因包括Ngn1、Ngn2和Ngn3,是碱性螺旋—环—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子的家族成员之一[2],在哺乳动物的CNS中广泛表达,包括海马中的锥形和颗粒神经元、嗅球中的谷氨酸能中间神经元、皮质中的锥体细胞和丘脑的大部分等区域。该家族是生物发育过程中转录网络的重要组成部分,在哺乳动物的神经系统中,不同类型的bHLH转录因子彼此调控、互相协调,广泛参与了神经发生与细胞增殖分化等基本生理过程,其中Ngn1和Ngn2在神经发生时活跃,Ngn3在胰腺组织和胰岛素分泌细胞的发育中需要[3]。Ngn1定位于5号染色体,最初在非洲爪蟾中发现[4],在谷氨酸螺旋神经节神经元的分化中起关键作用。它通过激活NeuroD1、Brm3a、GATA3和神经营养因子受体的下游级联,促进谷氨酸螺旋神经节神经元的正常分化[5]。同时,Ngn1具有决定神经元特性和亚型的功能,其生成的数量与特性在时间与空间上的顺序受限于增殖的神经祖细胞[6]。Ngn1可强烈诱导与神经细胞迁移相关的基因,激活神经发生的程序,包括细胞表面变化,诱导基因参与细胞迁移、转录因子和细胞周期调控因子[7]。可能通过干扰转录辅助因子介导多个启动子绑定的转录因子抑制胶质细胞基因激活。

2 Ngn1在神经发生过程中的作用

神经细胞分化的过程极其复杂,在不同阶段均有特定的标志基因被开放或关闭,Ngn1能够刺激神经祖细胞的神经元分化,但抑制胶质细胞分化[5],并对神经细胞亚型的分化起着关键作用。目前Ngn1在神经发育中已经得到较深入的研究。从非洲爪蟾和斑马鱼的神经管的分化、小鼠和鸡的皮质祖细胞体外诱导分化,再到诱导小鼠胚胎p19癌细胞等,Ngn1都是不可或缺的角色。Blader等[8]研究了斑马鱼胚胎发育过程中Ngn1基因调控情况,证实脊椎动物胚胎尽管缺乏原代神经元,但可通过相关的机制来诱导Ngn1表达。Murray等[9]首先克隆了小鼠Ngn1基因启动子区DNA2.7kb第一外显子片段,发现在内源性Ngn1条件诱导下对其神经系统特异表达具有决定作用。吴萌[10]以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA,简称RA)诱导小鼠胚胎瘤p19细胞分化模型模拟了胚胎干细胞被诱导转变为神经干细胞,继之成为神经前体细胞,直至终末分化成神经元细胞的整个过程,发现在此过程中Ngn1表达显著提高,其区域组蛋白H3多个位点出现乙酰化修饰状态,提示与Ngn1表达激活调控有关。Ngn1在缺血性卒中模型也有研究。急性卒中动物模型中,注射表达Ngn1神经诱导的骨髓间充质干细胞比注射亲代间充质干细胞更能有效地缓解神经功能缺损,且Ngn1的神经诱导可增强骨髓间充质干细胞的归巢能力,提高其在缺血大鼠脑内的植入效率[11]。闫晓波等[12]通过观察试管缺氧培养模型后发现,Ngn1能促进成鼠大脑室下区缺氧后NSCs增生,认为Ngn1在成鼠大脑缺血性脑卒中诱发的神经再生过程中可能具有促进其增殖的作用。此外,也有研究[13]认为,Ngn1和β-catenin对缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞的增殖和分化的共同协调,促进了神经元进行自我修复。

3 Ngn1与相关通路

3.1 Ngn1与JAK/STAT通路 大脑的神经元网络是十分复杂的,Ngn1促进神经发生和抑制星形胶质细胞形成是通过调节特定基因的活性来实现。JAK/STAT通路在神经损伤、神经修复和免疫系统中发挥重要作用,就神经发生而言,它一直充当着开关的角色:体外研究表明,Ngn1激活的同时会与启动子miR-9结合, 下调JAK/STAT途径上的关键成分, 实现Stat磷酸化的抑制, 从而抑制星形胶质细胞的形成[14]。使NSCs开始向神经元方向分化。因此Ngn1对NSCs的分化具有竞争性调控作用。

3.2 Ngn1与CBP/p300 作为转录共激活因子之一,环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB binding protein,CBP)结合原件组蛋白乙酰化酶CBP/p300目前受到广泛关注[15],CBP/p300属于组蛋白乙酰化酶的两个亚型,广泛参与各种组蛋白的乙酰化修饰,使染色质的空间结构变得疏松,利于基因表达。它能与多种转录因子相互作用,使转录因子被募集到启动子区域,促进转录起始复合物的形成,共同激活星形胶质细胞表达的相关基因。但Ngn1通过蛋白质—蛋白质相互作用,将激活剂复合物远离神经胶质分化基因。具体来说就是Ngn1螯合CBP/p300-Smad1的转录共激活因子复合物,从而阻断其与STAT胶质分化因子的相互作用,实现抑制星形胶质细胞特异性基因转录的作用[16]。

3.3 Ngn1与Wnt信号通路 Ngn1同时受Wnt信号的调节,β-catenin是Wnt信号通路中的关键分子,且作为Ngn1的上游基因,能上调Ngn1的表达[17]。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与细胞膜上的受体结合,激活细胞内信号通路,特异地启动、激活下游靶基因的转录,从而在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡等过程进行调节[18]。在经典Wnt信号通路中充当细胞内信号转导的β-catenin/TCF复合物直接结合Ngn1 mRNA以促进Ngn1蛋白在皮层神经元前体细胞中的转录,从而促进神经发生。

3.4 Ngn1与Notch信号通路 目前Notch信号通路已被认为对NSCs的发育至关重要,该信号通路是一条保守的信号转导途径,由两个邻近细胞的Notch受体与其配体相互作用而激活。研究表明,Notch信号通路通过抑制神经元分化和轴突再生,促进反应性星形胶质细胞增生[19],其靶基因主要是bHLH转录因子,包括Hes1、Hes5、Mash1、Ngn1和Ngn2等[20]。Notch信号负调节Ngn1表达,其中Hes1基因持续的过表达能下调Ngn1的表达,即Hes1可以起到拮抗易位基因Ngn1的活性,从而维持NSCs的稳定。

4 Ngn1与相关疾病

4.1 Ngn1与ALS 肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)又称“渐冻人症”,是指上运动神经元和下运动神经元损伤之后,导致包括球部(所谓球部,是指延髓支配的这部分肌肉)、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。有研究表明,ALS发病过程主要由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞及其释放的活性物质所介导的多种细胞之间复杂的相互作用所引发[21]。长期以来ALS的治疗一直成为医学领域无法攻克的难题,对此进行了大量的研究实验,其中有研究发现[22]在成年转基因模型鼠脊髓中Ngn1表达明显减少,推测ALS的发生与Ngn1的下调相关。治疗上[23],通过在间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中表达Ngn1基因,并移植到ALS小鼠模型中的神经元诱导可导致神经元样细胞迁移到CNS,系统移植MSCs-Ngn1可通过调节对单核细胞化学诱导蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)受体的表达水平及体外迁移活动对宿主神经细胞产生有利影响,提示神经诱导移植MSCs对长期治疗ALS有潜在益处,Ngn1的作用必不可少。若能在发病前期移植,MSCs-Ngn1可延迟疾病发作进展,而未经处理的MSCs无效[23],这将为ALS的治疗提供新的思路。

4.2 Ngn1与阿尔茨海默病 阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)又称老年性痴呆,是由神经元或神经胶质细胞缺陷引起,导致记忆衰退、认知障碍、痴呆和肢体运动障碍[24],为中枢神经系统退行性疾病之一,起病隐匿、进展性加重且不可治愈是其主要特点,近年来针对其发病及治疗机制研究逐渐深入,其中内源性诱导NSCs增殖与分化,替代损伤或坏死的神经细胞并重建神经通路,从而改善学习记忆能力,是干细胞治疗AD的机理之一。据报道,AD患者海马神经元线粒体较正常人有所减少,而在将NSCs移植到转基因AD小鼠模型中,发现其线粒体数量和线粒体相关蛋白表达显著增加[25],增加了神经细胞能量输出及其效率。Ngn1在神经发生过程中具有竞争性调控NSCs向神经元分化的关键作用,同样也参与了AD治疗某些关键环节[26]。海马齿状回颗粒下区的神经发生可以作为AD中的内源性修复机制,已有研究证实MSCs能在淀粉样蛋白-β(Aβ)相关的AD模型中通过增强Wnt信号通路促进神经元祖细胞分化为成熟神经元,调控海马神经发生[27]。本研究团队长期致力于补肾中药防治AD的临床与机制研究,研究发现[28]益肾化浊方能明显改善AD模型大鼠学习记忆能力,提高其海马区Ngn1基因表达水平,促进神经元Tubulin蛋白表达,抑制GFAP蛋白表达,由此推测益肾化浊方可能通过调控NSCs的分化促进神经元再生,进而改善其学习记忆功能,该作用与调控Ngn1基因的表达密切相关。

4.3 Ngn1与精神分裂症 多重证据表明精神分裂症源自异常的神经发育,因此参与脑结构发育的基因序列变异可能与导致精神分裂症中的结构变化发生重叠。目前在Ngn1基因敲除小鼠中观察到丘脑的发育不良[29],与在精神分裂症中看到的丘脑结构异常相似。有人[30]测序了来自爱尔兰高度精神分裂症家庭25名受试者的Ngn1基因,使用谱系不平衡试验(Pedigree Disequilibrium Test,PDT)和复杂疾病家系关联性分析(FBAT)发现,两个Ngn1相关的单核苷酸多态性(SNPs)的主要等位基因位点(rs2344484-C和rs8192558-G)在精神分裂症患者中更普遍,证明Ngn1变体可能对精神分裂症易感性有一定的影响,但需要更大的样本量来证实,必须注意的是Ngn1和精神分裂症之间存在相应的关系[31]。

5 Ngn1与相关疾病的中医治疗

由于神经系统的特殊性,目前很多神经系统疾病都缺乏有效的治疗措施。Ngn1可以通过对神经干细胞分化功能进行调控,从而达到神经再生、恢复相关神经功能等目的。但目前,尚未发现可具体调控Ngn1基因表达的方法。但有相关研究表明,中医药治疗手段可以很好地达到增加Ngn1 基因表达的功效,从而达到有效治疗目的。

5.1 中药治疗 神经再生与中医理论中“脑髓”功能活动相类似,那么人脑内神经元受损缺失的病理基础可能与肾中精气亏虚相关联[32]。实验研究表明,益肾化浊方可能通过增加AD模型中大鼠海马区Ngn1基因的表达,促进神经元再生及神经干细胞增殖并诱导其向神经元分化[28];缺血性卒中在我国发病率极高,中医上称之为“中风”,其后遗症期基本病机以“气虚血瘀”最为多见。补阳还五汤具有补气活血通络的功效,临床中可以起到很好的改善中风后遗症效果。研究发现,补阳还五汤可通过调节 NSCs Notch信号通路相关因子Ngn1等基因的表达水平从而促进 NSCs 的增殖[33]。

5.2 针灸治疗 目前研究发现,针灸治疗可以通过干预各类信号通路,从而调控NCSs增殖分化,达到抑制细胞凋亡、促进神经修复与再生的目的[34]。实验研究表明,对大椎穴、次髎穴等穴位进行电针治疗,可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路中Ngn1蛋白表达,达到促进脊髓内源性神经干细胞增殖与活化的目的,从而改善完全性骶上脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠的尿流动力学[35];此外,火针干预后的脊髓损伤模型大鼠Ngn1和Cyclin D1的基因表达量均明显升高,说明火针疗法也可以调控Ngn1和Cyclin D1的基因表达,从而达到恢复相关神经功能的作用[36]。

6 结语

目前对Ngn1的功能已有很多研究报道,但对其所调控的认识仍非常有限。例如Ngn1的转录如何被控制、活性如何调节、如何被募集到目的基因等都还有待进一步研究,可能与其他基因相似,受到多水平的调控。总体来说,Ngn1发挥作用的具体机理研究及如何与中医药治疗方法相结合将是今后研究的一个重要内容。深入研究Ngn1的功能和调节将有助于我们更好地理解神经系统发育的分子调控机制,以及为NSCs治疗诸多难治性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、精神分裂症等提供潜在的治疗途径或假设。