基于TG-FTIR-MS 技术的烟叶角质层热解行为研究

李亚玲，马 戎，丁 为，冯文宁，徐 波，梁 淼，刘玉斌，刘 伟，王 兵，乔学义

（1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450000；2.河北中烟工业有限责任公司，河北 石家庄 050000；3.四川中烟工业有限责任公司，四川 成都 610000；4.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000）

植物角质层是覆盖在高等植物果实、茎、叶等组织器官表面的一层生物聚合物膜[1-2]，其具有较强的疏水性，并且耐酸碱、耐氧化，能够保护植物免受外界微生物的侵染[3]，减少由于高温干旱引起的水分散失，以及抵抗紫外线、风力、机械作用等造成的伤害[4-6]，是植物实现自我防护的重要屏障，在植物适应逆境中发挥着重要作用。

烟草作为卷烟的原料，是一种特殊的经济作物，同时卷烟税收在国家财政收入中发挥着重要作用[7]。烟叶角质层在卷烟加工及感官品质中均扮演着重要角色。一方面，卷烟的加工是一个反复加水回潮和脱水干燥的过程，烟叶吸湿、解湿速率决定了烟叶加工所需的加水比例、贮存时间、能耗等，占据了卷烟加工的大部分生产成本，而烟叶角质层由于其天然的生理特性，与烟叶吸湿、解湿速率密切相关[8]。另一方面，烟草的香气是卷烟品质的重要组成部分，而烟叶中的很多致香物质主要存在于角质层中[9]。消费者抽吸卷烟的过程本身也是烟草燃烧、热解的过程，研究分离烟叶角质层，获取其化学组成特征，进而探索烟叶离体角质层的热解行为，有利于了解烟气中香味物质以及有害成分的形成机制与释放规律，更好地为卷烟产品开发服务，同时也尽可能降低烟草对健康的影响。

目前，关于烟草热解的研究较多[10-14]，而针对烟叶离体角质层的热解过程以及挥发分产物释放规律尚不清楚。鉴于此，选择不同产地（云南大理、湖南郴州、山东潍坊、黑龙江哈尔滨）烟叶，采用酶法、化学方法分离角质层，并通过扫描电子显微镜和傅里叶红外光谱仪对其进行表征观察与分析，然后采用热重-傅里叶红外光谱-质谱（TG-FTIR-MS）联用技术对离体角质层的热解行为及热动力学参数进行分析，研究其热解挥发分产物的释放规律与成分，旨在为烟叶热解研究提供依据，为植物角质层理论研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 烟叶角质层的分离

1.1.1 前处理 取云南大理、湖南郴州、山东潍坊、黑龙江哈尔滨的中部烤后烟叶，在温度为22 ℃、相对湿度为60%的恒温恒湿箱（HPP750eco 型号，德国Memmert 公司）中平衡24 h 后，用打孔器打孔得到若干个直径为15 mm的叶圆片。

1.1.2 果胶酶/纤维素酶法分离 用超纯水按1∶10的比例稀释液态的纤维素酶（活性为700 EGU/g，诺维信公司）和果胶酶（活性为10 968 PECTU/g，诺维信公司）原液，将配制好的果胶酶溶液、纤维素酶溶液以1∶1的体积比例混合。将打孔得到的烟片浸泡于酶解液中，放置在温度为45 ℃、相对湿度为70%的恒温恒湿箱中酶解24 h，以实现烟片角质层的分离。接下来将经过酶解分离出的烟叶角质层转移至超纯水中，放置室温条件下，以备后续试验使用。用酶法分离得到的云南大理、湖南郴州、山东潍坊、黑龙江哈尔滨4 个产地烟叶角质层，分别命名为EYD、EHC、ESW、EHH。

1.1.3 ZnCl2/HCl 法分离 按1 g 氯化锌（纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司）与1.70 mL 盐酸（化学纯，上海沪试实验室器材股份有限公司）的比例配制氯化锌和盐酸的混合溶液，将经过前处理后的叶圆片浸泡于混合液中，放置于室温条件下，反应24 h 之后，将烟片转移至盛有超纯水的离心管，并置于振荡器（HY-5 振荡器，金坛市中大仪器厂）中振荡，振荡频率为80～100 r/min，以加速角质层的分离。接下来将分离出的烟叶角质层转移至盛有干净超纯水的烧杯中，采用歌能牌超声波清洗机清洗纯化，去除黏连在角质层表面的其他细胞组织，其中超声波清洗机功率为360 W，清洗10 s左右，以去除表面残留物质。清洗干净后将角质层浸泡于超纯水中，放置室温条件下，以备后续试验使用。化学方法分离得到的云南大理烟叶角质层，命名为CYD。

1.2 烟叶离体角质层的结构表征

1.2.1 扫描电镜观测 将烟叶离体角质层用导电胶粘贴于铜质样品台上，经JFC-1600型离子溅射仪（日本Jeol 公司）喷金镀膜后，在JSM-6010LA 型扫描电镜（日本Jeol公司）下观察并拍照。

1.2.2 傅里叶红外光谱测定 将浸泡在超纯水中的烟叶离体角质层转移至干净的载玻片上，放入烘箱，30 ℃烘48 h，可得到烘干后的烟叶角质层。采用TENSOR27 傅里叶红外光谱仪（德国BRUKER 公司）利用KBr 压片法对烟叶离体角质层进行红外光谱测定，分辨率4 cm-1，波数4 000～600 cm-1，以KBr为空白，扣除背景值，室温下测试。

1.3 TG-FTIR-MS分析

采用Perkin Elmer 公司的TGA 8000 型热重分析仪、Spectrum 3型傅里叶红外光谱仪和Clarus SQ 8T型质谱仪进行试验。将烘干后的角质层样品称量约10 mg 装入坩埚中，先在炉中以50 ℃保温2 min，同时打开管线与质谱的连接阀，继续保温1 min，在保温时间快结束时对红外光谱内的背景信号进行采集，然后以20 ℃/min 的升温速率升温至900 ℃，并保温20 min，以40 mL/min 的氦气（纯度为99.999%）为气氛，开始升温的同时开启红外光谱采集数据，对烟叶离体角质层的热解曲线进行记录。试验程序设置在升温段前加3 min 的50 ℃保温段，以保证角质层在升温前全部处于同样的温度状态，并且此过程可以让氦气充满三联机仪器中，消除水分和空气中气体杂质的影响。将热重、红外、质谱之间的传输线温度设置为270 ℃，以防止气体产物冷凝。

1.4 热解动力学计算

将角质层的热解过程整体表示为A（固体）→B（固体）+C（气体）。

大部分反应在非等温条件下的动力学可通过等式总结为方程（1）：

在反应速率方程式（1）中，温度变化对速率常数k的影响较大，通常用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程来定量地描述这种温度依赖性：

式中，k为速率常数；A为频率因子（min-1）；E为活化能（kJ/mol）；T为温度（K）；R 为理想气体常数[8.314 J/（mol·K）]。

对于热重法得到的数据，α定义为下式：

式中，m0是反应开始时的初始质量，mt是时间t时的质量，m∞是反应结束时的最终质量。

通过上述速率方程式（1）由等温动力学数据获得反应过程中的动力学参数。对于由非等温试验得到的试验数据而言，可以通过利用下式将（1）进行变形，从而得到在恒定加热速率下的反应速率作为温度的函数的非等温下的速率表达式：

式中，dα/dT为非等温反应速率，dα/dt则为等温反应速率，dT/dt是恒定加热速率，通常用β表示。

将式（1）与（2）带入式（4），可以得到恒定加热速率下的非等温速率方程式的微分形式：

分离变量，并积分等式（5）可以得到非等温条件下的速率方程的积分形式：

其中，G（α）是积分形式的机制函数，定义如下：

表1 给出了常用的反应动力学模型、反应机制以及机制函数G（α）及f（α）的表达式。

表1 动力学机制函数模型Tab.1 Dynamic mechanism function models

对TG、微分热重（DTG）数据采用Coats-Redfern法进行分析。

通过对等式（6）中的温度近似积分，Coats-Redfern方程推导如下：

由 于2RT/E≪1，在 等 式（8）中ln[G（α）/T2]和（1/T）具有线性关系，并且活化能E和频率因子A可以通过拟合线性曲线的斜率和截距来计算。

2 结果与分析

2.1 烟叶角质层的结构表征

2.1.1 表面形态特征 采用酶法和化学方法均可分离得到烟叶角质层，图1 为2 种方法分离得到的云南大理烟叶角质层在电镜下的微观结构。如图1所示，角质层表面有很多纹理，凹凸不平，并不光滑，大量颗粒状蜡质呈现稀疏分布，偶见块状蜡质，表面分布有气孔和腺毛，气孔形态基本相同，气孔器由副卫细胞围绕成椭圆形，气孔为长条形，呈分散状分布。腺毛多内陷于角质层表面，轮廓清晰，形状饱满且光滑，大部分呈铲子状、蟹钳状。2种分离方法对比，化学分离法得到的离体角质层表面腺毛较少、颗粒状蜡质也较少，酶法分离得到的角质层表面皱褶较密集且明显，颗粒状蜡质和块状蜡质较为丰富。

图1 酶法（A）和化学方法（B）分离得到的烟叶角质层微观结构Fig.1 The microstructure of tobacco leaf cuticle separated by enzyme method（A）and chemical method（B）

2.1.2 傅里叶红外分析 如图2 所示，对不同分离方法及不同产地烟叶的离体角质层进行红外光谱表征。相同产地2 种不同分离方法以及4种不同产地烟叶角质层的红外光谱图峰形基本保持一致，但不同分离方法或产地的角质层某些特征峰信号强度不同。在3 413 cm-1处观察到的吸收峰表示氢键基团伸缩振动峰；在2 918、2 848、1 462、1 374、1 317 cm-1的峰来自-CH2基团的振动峰；2 360 cm-1和2 339 cm-1处的2个中强峰来自双键、三键类中的C=O、C=C、C≡C和C≡N的伸缩振动，从图2中可以明显看出，只有云南大理烟叶角质层在此处的峰信号不明显，其他3 个产地烟叶角质层在此处均出现了明显的吸收峰。在1 731 cm-1处有1 个相对较强的波段，属于酯羰基C＝O 的伸缩振动；在1 163 cm-1和1 101cm-1处的吸收峰属于酯基的不对称和对称伸缩振动。

图2 不同分离方法及不同产地烟叶角质层的红外光谱Fig.2 Infrared spectrum of cuticle of tobacco leaves with different separation methods and different producing areas

2.2 角质层的热失重过程分析

图3 显示了EYD、EHC、ESW、EHH 在氦气气氛下，升温速率为20 ℃/min 的热解TG 和DTG 曲线。从图3 可以看出，4 个不同产地烟叶离体角质层的热释放行为差异不大，根据DTG 曲线可以将角质层热解过程分为3个阶段，分别为失水阶段、快速脱挥发分阶段和碳化阶段。阶段Ⅰ为50～135 ℃，EYD、EHC、ESW 和EHH 分别失重4.80%、5.43%、5.61%、6.11%，这一阶段主要是角质层中的水分受热蒸发。阶段Ⅱ在135～595 ℃，为快速脱挥发分阶段，4 组样品的DTG 曲线在这一阶段均出现了3 个明显的失重峰，EYD、EHC 和ESW 3 组样品在275 ℃和460 ℃附近出现了2 个肩状侧峰，在340 ℃左右为尖状主峰，而EHH 样品在这3 个温度点均为尖状热解峰，说明在这一阶段发生了剧烈的热降解反应，角质层中的烷烃、脂肪酸、醇、萜类等化合物热解，释放出大量气态产物。EYD、EHC、ESW 和EHH 在此阶段的最大失重速率分别为0.36%/℃、0.37%/℃、0.46%/℃、0.29%/℃。第Ⅲ阶段在595～900 ℃，为碳化阶段，失重较少，剩余角质层残留物继续热解生成焦炭。EYD、EHC、ESW 和EHH 4 组样品的残余率分别为17.70%、17.42%、18.44%、20.00%，可以发现4组样品中EHH 不仅残余率最高，而且在DTG 曲线中最大失重速率最小，说明EHH样品的热稳定性相对较好。

图3 不同产地烟叶角质层热解的TG曲线（A）和DTG曲线（B）Fig.3 TG（A）and DTG（B）curves of tobacco cuticle pyrolysis from different areas

4 组试样的动力学参数如表2 所示。从表2 可以看出，采用最小二乘法对试验数据进行直线拟合所得最优拟合模型的相关系数（R2）值均在0.93 以上，说明采用的模型计算的结果是可靠的。对4 组样品采用了3 个不同温度区间进行动力学研究，可以发现在高温热解阶段（300 ℃以上）最优拟合模型均是化学反应二级（F2）模型。随着区间温度的升高，所得活化能逐渐升高，相应的频率因子也逐渐升高，体现了活化能与频率因子在热解过程中变化的一致性，4组样品在低温热解阶段（300 ℃以下）活化能在65.35～114.66 kJ/mol，高温阶段活化能在125.35～250.50 kJ/mol，说明角质层在高温阶段较难热分解。

表2 烟叶角质层的热解动力学参数Tab.2 Pyrolysis kinetic parameters of tobacco cuticle

2.3 角质层热解过程中挥发分析出的傅里叶红外分析

图4为不同产地烟叶角质层在氦气气氛下热解的三维红外光谱图。从图4 中可以看出，不同产地烟叶角质层热解的特征吸收峰主要位于2 931、2 360～2 315、1 765、1 115、672 cm-1，分别代表了热解过程中的主要产物。3 030～2 850 cm-1为CH4等烷烃中C-H 键伸缩振动区间，主要来源于角质层中的甲基（-CH3）、甲氧基（-OCH3）和亚甲基（-CH2-）裂解。2 500～2 250 cm-1和700～600 cm-1区间为CO2中C=O 键的伸缩振动区间，该化学键在红外光谱中吸收较为强烈，显示出明显的吸收峰，CO2主要来源于羰基和羧基化合物等包含碳氧元素物质的热解反应。1 800～1 710 cm-1区间为羰基化合物醛类、酮类以及羧酸类等含有的C=O 的伸缩振动吸收峰，醇类、酚类等C-O 键的伸缩振动主要体现在1 131～1 077 cm-1区间。

图4 不同产地烟叶角质层热解失重过程挥发分析出的三维红外光谱Fig.4 3D-FTIR diagram of volatilization analysis of tobacco cutide from different origins during pyrolysis and weightlessness

对三维红外谱图做切片处理，以吸光度为纵坐标，波数为横坐标，绘制在最大失重速率处的二维红外谱图，进而分析4 种不同产地角质层样品的挥发分的组成成分。图5 所示为4 组样品在3 个热解最大失重速率处挥发分析出的FTIR 图谱。随着热解温度升高，脂肪族C-H 的吸收峰明显增强，代表产物是CH4；芳香族C-H的吸收峰也增强，说明在热解过程中角质层的芳香性也在逐渐增加，这也导致在高温热解阶段的活化能增加；CO2的特征吸收峰随温度的升高而降低，说明在低温阶段羧基和羰基基本完全分解，产生了大量CO2的释放；C=O 伸缩振动的特征吸收峰随温度升高呈现先增强再减弱的趋势，在340 ℃左右峰值达到最大；C-O 的吸收峰与C=O的变化趋势相同，在340 ℃左右强度最大。

图5 最大失重速率处烟叶角质层热解挥发分析出的红外图谱Fig.5 FTIR spectrum obtained from pyrolysis volatilization analysis of tobacco cuticle at the maximum weight loss rate

2.4 角质层热解过程中挥发分析出的质谱分析

为了进一步研究角质层在热解过程中所释放的气态产物，使用质谱分析的主要离子片段选择特定的质荷比（m/z）实时生成热解产物的谱图。不同目标产物有着不同的分子离子碎片，选择质荷比m/z=43、45、59、91、94、106、162，分别代表的产物为羧酸类化合物、醚类化合物、酯类化合物、甲苯、苯酚、二甲苯、尼古丁，其热解过程生成量随温度的变化关系如图6 所示。从图6 可以看出，不同产地角质层的热解机制基本相同，各检测产物在角质层热解过程中均有产生，且这些物质的释放温度区间较为接近，多集中在300～600 ℃温度区间内，其中以羧酸类化合物和甲苯居多，质谱响应信号在107数量级，其他气体产物的生成量相对较少。羧酸类物质在200 ℃附近开始产生，分别在350 ℃和550 ℃左右出现2 个质谱响应信号峰值；醚类物质生成量随温度呈现先升高后降低的趋势，峰值出现在390 ℃左右；酯类物质生成量较少，260 ℃左右开始出现，到510 ℃附近达到最大值后逐渐下降；3个苯系物生成量变化趋势基本相同，其中甲苯的生成量最多，250 ℃左右开始产生，530 ℃左右达到峰值，苯酚则较早达到峰值，在500 ℃左右已达到质谱响应信号的最大值，二甲苯不仅生成量少，在540 ℃左右才达到峰值。可能是由于角质层与细胞壁紧密连接，分离后的角质层中黏附有部分细胞壁组织，在热解过程中出现尼古丁随温度变化的质谱响应信号，从250 ℃开始生成，到520 ℃左右达到峰值。在整个热解过程中，角质层热解释放最多的是羧酸类物质，且在相对较低的热解温度出现，其次是甲苯，醚类物质和苯酚的生成量相差不大，二甲苯和酯类物质生成量则较少。

图6 烟叶角质层热解过程析出气体随温度变化质谱曲线Fig.6 Mass spectrum curve of gas evolution with temperature during tobacco cuticle pyrolysis

3 结论与讨论

采用酶法和化学方法均可分离出烟叶角质层，对其进行扫描电镜观察，结果发现，烟叶离体角质层表面有纹理且凹凸不平，大量颗粒状蜡质呈现稀疏分布，偶见块状蜡质，表面分布有气孔和腺毛，气孔形态基本相同，气孔器由副卫细胞围绕成椭圆形，气孔为长条形，呈分散状分布。腺毛多内陷于角质层表面，轮廓清晰，形状饱满且光滑，大部分呈铲子状、蟹钳状。这与张译丹等[15]、徐静[16]观察的烟草表皮形貌基本相同。

傅里叶红外光谱可用于推断角质层表面官能团的种类[17-18]，4 个不同产地角质层的红外光谱显示，在3 413 cm-1处观察到的吸收峰表示羟基官能团的伸缩振动，当羟基成氢键时，代表氢键基团伸缩振动峰，另外在3 600 cm-1附近没有红外吸收表明角质层物质中没有明显的游离羟基[18]。2 918、2 848、1 462、1 374、1 317 cm-1处的峰来自-CH2基团的振动峰，属于角质层中蜡质、角质和角碳等脂肪性组分[19-21]。云南大理烟叶角质层在2 360 cm-1和2 339 cm-1处出现的2 个中强峰来自双键、三键类中的C=O、C=C、C≡C和C≡N的伸缩振动[22-23]。在1 731 cm-1处有1 个相对较强的波段，属于角质聚合物中酯羰基C＝O的伸缩振动[18]，在1 163和1 101 cm-1处的吸收峰属于酯基的不对称和对称伸缩振动，这些吸收峰与角质单体在聚合物形式中的酯交换作用有关[24]。1 248、1 071、1 024 cm-1为C-O 伸缩振动，代表了角质层多糖中的含氧官能团[24-25]。角质层的芳香族结构域在1 650～1 500 cm-1处有1 个吸收峰，表明在角质层上存在酚类化合物[24]。这与查燕等[26]对马尾松、海桐、桂花叶片角质层的红外光谱表征结果类似。

4 种不同产地角质层的热解过程相差不大，根据DTG 曲线可以将其分为3 个阶段，分别为失水阶段（50～135 ℃）、快速脱挥发分阶段（135～595 ℃）和碳化阶段（595～900 ℃）。在快速脱挥发分阶段，4组样品的DTG 曲线在这一阶段均出现了3 个明显的失 重 峰，EYD、EHC 和ESW3 组 样 品 在275 ℃和460 ℃附近出现了2个肩状侧峰，在340 ℃左右为尖状主峰，而EHH 样品在这3 个温度点均为尖状热解峰。EYD、EHC、ESW 和EHH 在此阶段的最大失重速率分别为0.36%/℃、0.37%/℃、0.46%/℃、0.29%/℃。离体角质层成分主要为烷烃、脂肪酸、醇、萜类等化合物[16，27]，较烟叶成分更为单一，在热解过程中角质层的热释放主要集中在1 个阶段，而烟叶的热解可明显分3 个主要的阶段[28]。对快速脱挥发分阶段采用3 个不同温度区间进行动力学研究，可以发现在高温热解阶段（300 ℃以上）最优拟合模型均为化学反应二级（F2）模型。随着区间温度的升高，所得活化能逐渐升高，相应的频率因子也逐渐升高，出现该现象的主要原因可能是，随着温度的升高热解程度逐渐增加，前期分解活化能较低的物质大量释放，难分解的物质比重增加，且样品的芳香结构有序化程度升高和结构中含氧官能团的降低，导致角质层发生热解反应所需克服的能垒明显升高[29-30]。

通过TG-FTIR-MS 联用技术分析可知，4 组烟叶离体角质层样品热解产生的气体成分主要包括CH4和CO2。随着热解温度升高，脂肪族C-H 的吸收峰明显增强，代表产物是CH4，这主要是由于脂肪族烷烃侧链发生裂解和重排，甲氧基（-OCH3）、甲基（-CH3）和亚甲基（-CH2）脱落[31-33]；芳香族C-H 的吸收峰也增强，说明在热解过程中角质层的芳香性也在逐渐增加，主要是因为脂肪链和含氧组分逐步转化为芳香结构[34-35]，这也导致在高温热解阶段的活化能增加；CO2主要来源于角质层中的脱羧基和羰基裂解[31]，说明在低温阶段羧基和羰基基本完全分解，产生了大量CO2的释放；C=O 伸缩振动的特征吸收峰随温度升高呈现先增强再减弱的趋势，说明在热解过程中产生了醛类和酮类化合物[31]。C-O 与C=O 吸收峰的出现，主要是由于醇、酚类产物的析出[23]。气态产物多集中在300～600 ℃温度区间，其中以羧酸类化合物和甲苯居多。苯系物生成量随温度呈现先升高后降低的趋势，250 ℃左右开始产生，在500～540 ℃区间达到峰值。这与李晓亮等[36-37]对烟草热解过程中关键物质的释放浓度曲线随温度变化的趋势基本相同。烟叶角质层的热解主要释放出一些低分子质量的挥发性成分（如羧酸类、酯类等）和具有特殊香气的物质（如芳香族化合物等），与王健等[38]的研究对比，可发现羧酸类化合物在角质层热解过程中的释放要早于在烟草中的热解释放，这主要是因为来源不同，烟草热解中的羧酸类物质主要来源于组分中纤维素的分解[37]，而角质层中的主要成分是脂质，在热解过程中会生成羧酸和芳香族化合物[39]，脂质的热解温度在200 ℃左右[40]，而纤维素的起始热解温度在250 ℃[41]。尼古丁主要存在于烟叶细胞的细胞液和液泡中，也有一部分存在于细胞壁和细胞间隙中[42]，可能是由于角质层与细胞壁紧密连接，分离后的角质层中黏附有部分细胞壁组织，在热解过程中出现了尼古丁随温度变化的质谱响应信号。对比王健等[38]的研究，发现角质层的热解主要释放出一些低分子质量的挥发性成分（如羧酸类、酯类等）和具有特殊香气的物质（如芳香族化合物等）。

本研究经过酶法、化学方法分离烟叶角质层，通过扫描电子显微镜和傅里叶红外光谱仪对其进行表征分析，采用TG-FTIR-MS 联用技术对烟叶离体角质层的热解行为、动力学参数以及挥发分产物的释放规律进行研究，可为进一步了解烟叶的组织结构对烟叶热释放行为的影响提供思路。但本研究主要侧重于烟叶离体角质层实时在线的热解反应过程，对于角质层在热解过程中会产生哪些具体产物以及对烟气中香味成分的贡献还需要进一步研究。