QuPPe-高效液相色谱-串联质谱法测定3 种根茎类药材中矮壮素和甲哌鎓残留量

杜梓萱，曹佳音，李雯婷，周逸凡，苗 水*，季 申*

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203； 2.上海市食品药品检验研究院国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203）

植物生长调节剂（下文简称“植调剂” ） 是一类具有与植物激素相似生理活性的人工合成农药［1］。其中矮壮素和甲哌鎓是我国普遍使用的2 种植调剂，矮壮素常被用作植物生长延缓剂，可促进光合作用，甲哌鎓可抑制农作物过度增长、提高产量，两者均可增强植株的抗逆性［2］，但其不良影响已被广泛研究和报道［3-4］。

矮壮素和甲哌鎓极性较大、挥发性低、无发色或荧光基团，在酸性条件下具有热稳定性［5］，在紫外-可见光区没有吸收。目前检测方法有离子色谱法［5］、高效液相色谱法［6］、表面增强拉曼光谱法［7］等，操作繁琐。液质联用技术可解决此问题［8-9］，可通过在流动相加入离子对试剂，如三氟乙酸［10］或七氟丁酸［11］，进行反相柱分析。但这些试剂会导致电离抑制、灵敏度降低［12］、仪器污染，而亲水相互作用液相色谱（HILIC） 因不需要加入离子对试剂而得到应用［13］。课题组前期基于传统QuEChERS 方法检测74种农药/植调剂［14］时发现矮壮素和甲哌鎓的回收率低，可能是因为极性较大、易残留于水相。

QuPPe-PO-Method 是针对植物源食品中极性农药残留分析而开发出的一种快速检测方法［15-17］。本研究参考该方法，对提取溶剂和净化材料进行考察，采用HILIC 模式的Amide 酰胺色谱柱及分散固相萃取材料PXA，建立了LCMS/MS 测定延胡索、板蓝根和桔梗这3 种根茎类药材中矮壮素和甲哌鎓的方法，并对多批样品中的矮壮素和甲哌鎓残留状况进行了检测分析。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； AB SCIEX 6500＋三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX公司）； 岛津UV 2550 紫外光谱仪（日本岛津公司）； 5810 R 离心机、移液枪（德国Eppendorf 公司）； KS 260 basic 平板振荡仪 （德国IKA 公司）； Milli-Q 超纯水器 （美国Millipore 公司）； MSU225P-1CE-DU 电子天平、SQP 电子天平（十万分之一、万分之一，德国Sartorius 公司）； VTX-3000L 涡旋混合仪（德国CLN Freising 公司）。

1.2 试剂与药物 10 mol/L 甲酸铵、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Sigma 公司）； 甲酸（质谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）； 分散固相萃取 （dSPE） 净化粉末PXA、SAX、反相硅胶键合吸附剂C18（北京迪科马科技有限公司）； 矮壮素（纯度99.0%）、甲哌鎓（纯度99.0%）、矮壮素同位素内标 （纯度99.0%） 对照品 （德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）。收集32 批延胡索、32 批板蓝根和12 批桔梗药材，均由上海市食品药品检验研究院中药天然药物所杨新华主管药师鉴定为正品，均粉碎、过3 号筛。

2 方法

2.1 对照品溶液制备 精密称取各对照品10 mg 于10 mL量瓶中，用1%甲酸甲醇溶解，稀释至刻度，制成1 mg/mL的对照品储备溶液，-20 ℃冰箱保存。用1%甲酸甲醇稀释制成10 μg/mL 的对照品溶液。内标化合物氘代矮壮素的内标储备液和稀释内标溶液同法制备。

2.2 供试品溶液制备 提取： 对多批延胡索、板蓝根和桔梗进行筛查，分别找出矮壮素和甲哌鎓阳性的药材和空白药材。称取药材粉末2 g，置50 mL 聚苯乙烯离心管中，加入10 mL 超纯水，摇散，加入10 μg/mL 内标溶液125 μL，加入10 mL 1% 甲酸甲醇溶液，500 次/min 振荡15 min，-20 ℃下冷冻净化30 min，于4 ℃下3 900 r/min 离心15 min。

净化： 精密量取10 mL 上清液置于含500 mg dSPE PXA 粉末的15 mL 聚丙烯离心管中，500 次/min 振荡15 min，于4 ℃下3 900 r/min 离心15 min，取上清液2 mL 过0.22 μm 的PTFE、PES 或Nylon 微孔滤膜，取0.8 mL 滤液置于液相小瓶中，加入0.2 mL 的1%甲酸甲醇-水（1 ∶1）溶液，3 000 r/min 涡旋1 min 混合均匀，即得。

2.3 分析条件

2.3.1 色谱 Waters XBridge® BEH Amide （3.0 mm×100 mm，2.5 μm） 色谱柱； 流动相水（含50 mmol/L 甲酸铵，甲酸调至pH ＝3） （A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～0.5 min，97%B； 0.5～4 min，97% ～70% B； 4 ～5 min，70% ～50%B； 5～6 min，50%B； 6～6.1 min，50% ～97%B； 6.1～10 min，97%B）； 体积流量0.4 mL/min； 柱温35 ℃； 进样量1 μL。

2.3.2 质谱 电喷雾离子源（ESI）； 正离子模式； 多反应监测模式； 电喷雾电压5 500 V； 雾化气压力344.75 kPa；辅助加热气压力379.23 kPa； 气帘气压力275.80 kPa； 碰撞气压力55.16 kPa； 离子源温度500 ℃； 扫描时间0.3 s；碰撞室入口电压10 V； 碰撞室出口电压12 V。为了校正操作过程误差，采用同位素内标法定量，以矮壮素-d4 作为内标。主要质谱参数见表1，总离子流图见图1。

图1 各成分总离子流图（2 μg/L）

表1 各成分主要质谱参数

3 结果

3.1 提取方法选择 采用矮壮素和甲哌鎓阳性延胡索药材进行提取条件的考察。选取1%甲酸乙腈-水（1 ∶9）、1%甲酸乙腈-水（3 ∶7）、1%甲酸乙腈-水（5 ∶5）、1%甲酸乙腈-水（7 ∶3）、1%甲酸甲醇-水（1 ∶9）、1% 甲酸甲醇-水（3 ∶7）、1% 甲酸甲醇-水（5 ∶5）、1% 甲酸甲醇-水（7 ∶3） 作为提取溶剂，室温下500 次/min 振荡提取15 min。空白药材以相应方法提取得到药材基质溶液，并制作标准曲线进行准确定量。以矮壮素和甲哌鎓的提取量作为考察指标，结果见图2。可知，1%甲酸甲醇-水（5 ∶5） 同时对矮壮素和甲哌鎓具有最好的提取效果，故选择该溶剂作为提取溶剂进行后续实验。本实验参考欧盟QuPPe 标准，在提取溶剂中加入少量甲酸有利于矮壮素和甲哌鎓质子化或解离。

图2 不同提取溶剂对植调剂的提取结果（n＝4）

3.2 净化条件选择 根据前期结果，矮壮素和甲哌鎓这类极性较强的离子型化合物，适用以阴离子交换为原理的分散固相萃取净化材料，故重点考察以强阴离子交换为原理的SAX、以混合型阴离子交换为原理的PXA 及常用的反相硅胶键合吸附剂C18。SAX 为硅胶键合季铵基团的吸附剂，PXA 为含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物上键合季铵基团，均可用于含水样品、生物体液以及有机相中阴离子化合物的纯化。C18对非极性、弱极性以及中等极性化合物均有广泛保留，是目前分散固相萃取中应用最广的吸附剂。

按照“2.2” 项下方法制备药材提取液，精密量取10 mL 分别加入含有500 mg C18、500 mg SAX、500 mg PXA 分散固相萃取净化粉末的离心管中，500 次/min 振荡15 min，于4 ℃下3 900 r/min 离心15 min，取上清液2 mL 过0.22 μm 的PTFE、PES 或Nylon 微孔滤膜。延胡索取0.5 mL 滤液，加10 mL 1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 稀释，板蓝根和桔梗取1 mL 滤液，加10 mL 1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 稀释，均3 000 r/min 涡旋1 min，混合均匀，即得供试品溶液，紫外光谱法检测。以不同材料对药材的净化效果为考察指标，结果见图3。可知，3 种净化材料对药材提取液的净化效果从高到低依次为PXA、SAX、C18。3 种药材的提取溶液在PXA 下均得到不错的净化效果，并考虑到方法的普适性，故选择PXA 作为净化材料。

图3 紫外光谱下不同净化材料对3 种药材的净化结果

3.3 方法学考察

3.3.1 基质效应、线性范围、定量限与检出限 根据SANTE 11312/2021［18］，在LC-MS/MS 分析中，使用共提取基质组分分析待测物是基质效应（ME） 的主要原因。采用延胡索、板蓝根和桔梗空白药材建立含药材基质溶液的标准曲线，利用“加标提取法” 对ME 进行评价。用外标法分别建立含药材基质的基质标准曲线和不含药材基质的溶剂标准曲线（权重1/X），制备过程见表2，不含药材基质的溶剂标准曲线建立时将其药材基质替换为1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 即可。不同药材间比较基质效应ME，公式为。计算得到的矮壮素和甲哌鎓在3 种药材中的基质效应的绝对值见图4。由于ME 值均大于20%，故采用含基质溶剂的标准曲线和同位素内标进行分析。

图4 延胡索、板蓝根和桔梗基质效应绝对值（n＝3）

表2 含基质溶剂的标准曲线制备（n＝3）

为保证数据的准确性，采用内标法建立含药材基质标准曲线，计算药材中矮壮素和甲哌鎓的含量。制备过程见表2，在1～400 μg/L （1、2、5、10、50、100、200、300、400 μg/L） 范围内测定9 个浓度梯度的标准溶液。以待测成分与内标的浓度比为横坐标（X），以峰面积比为纵坐标（Y） （权重： 1/X），建立标准曲线回归方程，结果见表3。可知，药材基质中各成分在一定范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998。

表3 各植调剂线性关系（n＝3）

3.3.2 准确度与精密度试验 按照“2.2” 项下方法，从低到高分别制备4 种加样水平（20、100、500、1 000 μg/kg）的溶液（n＝3）。用内标法建立的含基质标准曲线计算回收率。连续进样4 个水平的样品溶液3 d，根据峰面积计算日内和日间的精密度。各药材中待测物的平均回收率、日内和日间精密度见表4。各浓度水平下待测成分的平均加样回收率分别为95.9% ～105.0% （延胡索）、83.2% ～103.7%（板蓝根）、76.7% ～101.9% （桔梗）。3 种药材的日内精密度均小于5.7%，日间精密度均小于6.2%。

表4 各植调剂的平均加样回收率、日内和日间精密度（n＝3）

3.4 样品检测 应用新建方法对32 批延胡索（编号分别为YHS1-YHS32）、32 批板蓝根 （编号分别为 BLG1-BLG32）、12 批桔梗（编号分别为JG1-JG12） 进行检测，不同批次药材之间进样空白溶剂，以确保不存在交叉污染。结果延胡索、板蓝根和桔梗中矮壮素的检出范围分别为31.7～86.9、20.5 ～12 094.8、91.8 ～109.7 μg/kg，检出率分别为12.5%、87.5%、91.7%； 延胡索中甲哌鎓的检出范围为20.4～3 382.9 μg/kg，检出率为28.1%； 板蓝根和桔梗中未检出甲哌鎓，见图5。

图5 样品中植调剂检测结果（n＝3）

目前，延胡索、板蓝根和桔梗中矮壮素和甲哌鎓的最大残留限量（MRL） 在GB 2763—2021 中并未明确规定，矮壮素在大麦等中的MRL 为2 000～10 000 μg/kg，甲哌鎓在小麦中的MRL 为500 μg/kg。参考欧洲委员会法规No.396/2005 欧洲农药数据库［19］，矮壮素和甲哌鎓在甘草、姜黄等中的MRL 均为50 μg/kg； 参考联合国粮农组织的国际食品标准农药数据库［20］，矮壮素在小麦等中的MRL 为2 000～6 000 μg/kg； 甲哌鎓无相关MRL。参考美国环境保护署联邦法规［21-22］，矮壮素在燕麦、小麦等中的MRL 为2 000～40 000 μg/kg，甲哌鎓在棉花中的MRL 为2 000 μg/kg。

由图5 可知，在延胡索、板蓝根和桔梗部分样品中检出矮壮素，其中矮壮素含量及检出率较高的为板蓝根和桔梗。国家中医药管理局发布的《中药材生产质量管理规范》（2022 年第22 号） 附件中规定“禁止使用壮根灵、膨大素等生长调节剂调节中药材收获器官生长”［23］。课题组在暗访河南、安徽、山东等地的板蓝根和延胡索种植基地发现，很多种植户盲目地喷洒矮壮素等促进根茎膨大的植调剂，快速促进药用部位生长，大幅缩短药材的种植周期，甚至使药材性状发生了变化，可不同程度地影响中药材的品质。从分析的多批根茎类药材中也可看出，矮壮素和甲哌鎓在中药材种植过程中滥用较为明显。

4 结论

本研究建立了QuPPe-LC-MS/MS 法同时测定3 种根茎类药材中的矮壮素和甲哌鎓的残留量。基于1%甲酸甲醇-水（1 ∶1） 的提取体系，可以最大程度地提取药材中的目标化合物，同时利用分散固相萃取PXA 粉末，方便快捷且同时达到净化药材提取液和保持待测化合物较高回收率的目的。根据欧盟指南，从ME、线性关系、LOQ、LOD、准确度和精密度等方面验证了本研究新建方法的可行性。该方法符合指南的要求，可用于中药样品中矮壮素和甲哌鎓的残留检测。本研究为对极性较强的水溶性植调剂检测的进一步探索，为规范延胡索、板蓝根和桔梗人工种植中植调剂的施用及保障药材质量与安全提供技术支持。