炮制对加味拱辰浓缩丸化学成分的影响

张亚柯，张宏伟，张振凌，2*，朱建光，李德华，孙梦梅，赵永琪，王一鸣

（1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046； 2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450018）

拱辰丹出自《叶氏录验方》［1］，由当归、山萸肉、鹿茸、麝香组成，而加味拱辰丹是河南保和堂名中医在其基础上添加熟地黄、红参而成，临床上主要用于早发性卵巢功能不全的治疗［2-3］。在拱辰丹传承过程中，历代医家对当归、山萸肉是否使用炮制品入药存在不同看法，（1） 当归，《魏氏家藏方》［4］等以酒当归入药，《女科百问》［3］《世医得效方》［5］等以生当归入药，而现代医家认为，脉络瘀阻为早发性卵巢功能不全持续存在的病理状态［6］，酒制后其活血、祛瘀、通经的作用可得到增强［7-8］； （2） 山萸肉，历代古籍中均以生品入药，而现代方加味拱辰丹以酒萸肉入药，于慧等［9］发现，酒萸肉组中环烯醚萜苷等有效成分含量高于生萸肉组中，与山茱萸酒制前后环烯醚萜苷含量变化趋势不同［10-12］，表明合理配伍可有效提高处方疗效。课题组前期将加味拱辰丹开发成浓缩丸以减少服用量、提高依从性，而本实验考察炮制对该制剂化学成分的影响，以期为其后续开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 VanquishTMFlex 型超高效液相色谱系统、Orbitrap ExplorisTM120 型高分辨率质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； Waters 2489 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； BT125D 型电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； GZX-9070 MBE 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）； HH-S6 数显恒温水浴锅 （常州市华普达教学仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 藁本内酯、莫诺苷、绿原酸对照品 （四川省乐美天医药有限公司，批号DSTDH000702、DST210508-039、DSTDL002102，纯度≥98%）； 马钱苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111640-201606，纯度98.3%）； 阿魏酸、马钱苷酸、5-羟甲基糠醛对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号 G13S11L124423、M07HB177364、H12M9Z61023，纯度≥98%）； 没食子酸对照品（成都普思生物科技有限公司，批号PS0258-0050，纯度98.5%）； 山茱萸新苷对照品 （ 成都埃法生物科技有限公司，批号AF20091301，纯度≥98%）。当归、山萸肉、熟地（批号211103781、210901601、210800199，康美药业有限公司）； 鹿茸、红参、麝香（河南省保和堂医药有限公司），均经河南中医药大学张振凌教授鉴定为正品。甲酸、乙腈、甲醇均为质谱纯； 磷酸为色谱纯； 其他试剂均为分析纯； 水为超纯水和饮用水。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备

2.1.1 酒当归 取净当归片适量，加入一定量黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后置于炒制容器中，文火加热炒至深黄色，取出晾凉，即得（每100 kg当归片用10 kg 黄酒）。

2.1.2 酒萸肉 取净山萸肉适量，黄酒拌匀后置于蒸制容器中，隔水蒸透至黑润，取出，干燥，即得（每100 kg 山萸肉用20 kg 黄酒）。

2.2 浓缩丸制备 根据前期预实验条件，将当归、山萸肉、熟地黄粉碎后过4 号筛，加入15 倍量60%乙醇，加热回流提取2 次，每次1.6 h，合并滤液，浓缩成相对密度为1.35 （60 ℃） 的稠膏；鹿茸、红参粉碎后过6 号筛，人工麝香研细，与上述稠膏充分混匀，得到软硬适中的丸块，制丸，干燥，即得。

2.3 UPLC-MS 成分分析

2.3.1 色谱条件 Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～2 min，97%B； 2 ～21 min，97% ～75% B； 21 ～30 min，75% ～35% B；30～32 min，35%B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温30 ℃； 进样量2 μL。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子扫描； 质量扫描范围m/z80 ～1 200； 鞘气体积流量45 arb； 辅助气体积流量15 arb； 雾化温度350 ℃； 离子传输管温度320 ℃； 喷雾电压3.5、-2.5 kV。

2.3.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，50%甲醇溶解得贮备液，精密吸取适量，制成分别含莫诺苷13.13 μg/mL、马钱苷13.43 μg/mL、绿原酸12.37 μg/mL、藁本内酯11.83 μg/mL、马钱苷酸12.37 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.4 供试品溶液制备 将浓缩丸粉碎后精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，称定质量，超声处理30 min，冷却至室温，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1 mL 至10 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，12 000 r/min 离心15 min，取上清液，即得。

2.4 化学成分鉴定 在正负离子模式下分别对生品组、炮制品组、酒当归组、酒萸肉组数据进行采集，结果见图1。再通过Xcalibur 3 软件获取保留时间、准分子离子精确质量数、二级碎片等信息，与已有对照品质谱信息进行比对，并结合相关文献、PubChem 数据库进行定性分析。结果，共鉴定出97 个化合物，包括环烯醚萜类、有机酸类、皂苷类、苯肽类、核苷类、氨基酸类等主要结构，具体见表1。

表1 加味拱辰浓缩丸化学成分鉴定结果Tab.1 Results for chemical constituent identification of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

图1 加味拱辰浓缩丸BPI 图Fig.1 BPI profiles of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5 化学模式识别

2.5.1 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.1软件对各组质谱数据进行无监督模式的PCA 分析，结果见图2。由此可知，各组组内聚合度良好，组间区分为4 类，表明加入不同炮制品后化学成分存在明显差异。

图2 加味拱辰浓缩丸PCA 得分图Fig.2 PCA score plot for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5.2 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）在PCA 分析基础上采用有监督模式的OPLS-DA 分析，发现所构建5 个模型的R2X、R2Y、Q2均大于0.9，表明模型具有良好的预测能力和拟合度，再对各组数据进行200 次置换检验，发现交叉验证后模型截距均低于原始模型截距，R2拟合直线在Y轴的截距均小于0.3，Q2拟合直线在Y轴的截距均为负数，表明模型未存在过度拟合现象，预测能力良好，见图3。

图3 加味拱辰浓缩丸OPLS-DA 得分图与验证模型Fig.3 OPLS-DA score plots and verification models for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

然后，以VIP＞1、P＜0.05 为标准对两两组别之间进行差异成分筛选，结果见图4、表2。由此可知，生品组和炮制品组中26 种差异成分具有统计学意义，酒萸肉组和生品组中27 种差异成分具有统计学意义，酒当归组和生品组中21 种差异成分具有统计学意义，炮制品组和酒当归组中25 种差异成分具有统计学意义，炮制品组和酒萸肉组中22 种差异成分具有统计学意义； 生品组和炮制品组、酒当归组和炮制品组、生品组和酒萸肉组中差异成分重合度高，数量相近，炮制品组和酒萸肉组、生品组和酒当归组中差异成分数量减少，重合度降低，表明生品组和酒当归组相似度较高，炮制品组和酒萸肉组相似度较高。

表2 加味拱辰浓缩丸差异成分Tab.2 Differential constituents of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

图4 加味拱辰浓缩丸S-plot 散点图Fig.4 S-plot scatter plots for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.6 差异成分含量测定 在定性分析基础上结合文献［11，12，34-35］ 报道，综合考虑含量、药理活性、紫外吸收情况，选择莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷、没食子酸、阿魏酸、绿原酸、马钱苷酸、藁本内酯、5-羟甲基糠醛进行含量测定。

2.6.1 色谱条件 SymmetryShieldTMRP18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.5%磷酸（B），梯度洗脱（0～25 min，4% ～14%A；25 ～50 min，14% ～23% A； 50 ～60 min，23% ～25.5%A； 60～62 min，25.5% ～4% A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长254 nm； 进样量10 μL。色谱图见图5。

图5 各成分HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.2 对照品溶液制备 精密称取5-羟甲基糠醛、没食子酸、马钱苷酸、山茱萸新苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、藁本内酯、绿原酸对照品适量，50%甲醇制成质量浓度分别为0.092、0.254、0.244、0.222、1.580、1.170、0.110、0.490、0.128 mg/mL的贮备液，精密吸取除5-羟甲基糠醛以外的8 种贮备液适量，混匀，50%甲醇稀释成不同质量浓度； 精密吸取5-羟甲基糠醛贮备液适量，50%甲醇稀释成不同质量浓度，即得。

2.6.3 供试品溶液制备 本品干燥、粉碎后精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，称定质量，超声处理30 min，冷却至室温，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.6.4 线性关系考察 取不同质量浓度对照品溶液适量，在“2.6.1” 项色谱条件下各进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.6.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、马钱苷酸、山茱萸新苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、藁本内酯、绿原酸、5-羟甲基糠醛峰面积RSD 分别为1.13%、1.21%、1.93%、1.68%、1.80%、1.02%、1.21%、1.82%、0.91%，表明仪器精密度良好。

2.6.6 重复性试验 平行制备供试品溶液6 份，在“2.6.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、马钱苷酸、山茱萸新苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、藁本内酯、绿原酸、5-羟甲基糠醛含量RSD分别为1.36%、0.75%、1.02%、1.85%、1.24%、1.71%、1.15%、1.69%、1.43%，表明该方法重复性良好。

2.6.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、马钱苷酸、山茱萸新苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、藁本内酯、绿原酸、5-羟甲基糠醛峰面积RSD 分别为1.54%、0.65%、1.80%、1.55%、1.92%、1.06%、0.78%、1.17%、1.29%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品粉末6 份，每份约0.25 g，精密称定，按100%水平精密加入对照品溶液适量，按“2.6.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、马钱苷酸、山茱萸新苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、藁本内酯、绿原酸、5-羟甲基糠醛平均加样回收率分别为98.50%、99.28%、98.57%、100.08%、99.63%、99.90%、99.07%、100.12%、98.84%，RSD 分别为 1.69%、1.25%、0.86%、1.92%、0.67、1.37%、0.93%、1.56%、1.73%。

2.6.9 样品含量测定 平行制备生品组、炮制品组、酒当归组、酒萸肉组样品各 5 份，按“2.6.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。由此可知，藁本内酯在酒萸肉组中含量最高； 炮制品组和酒萸肉组中没食子酸含量约为生品组和酒当归组中的4 倍，有机酸总含量约为后两者中的1.5倍，环烯醚萜苷总含量接近。

表4 各成分含量测定结果（mg/g）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g）

2.6.10 聚类分析 采用Heml 1.0 软件，以各成分含量为指标进行分析，结果见图6。由此可知，同一组别5 批样品各自聚为一类，表明其质量一致性良好； 生品组和酒当归组聚为一类，炮制品组和酒萸肉组聚为一类，表明两两组别之间各成分含量变化规律相似； 数值越大，颜色越暖，相应成分含量越高，而炮制品组和酒萸肉组暖色调占比较大，表明其所含成分含量整体上较高。

图6 各成分含量聚类热图Fig.6 Cluster heatmap for contents of various constituents

3 讨论

3.1 定性定量分析 生品组、炮制品组、酒当归组、酒萸肉组中均鉴定出环烯醚萜苷、有机酸、苯肽、核苷、氨基酸、皂苷6 种主要构型，化学成分数量也无明显差异。以VIP ＞1、P＜0.05 为标准，分别对两两组别进行OPLS-DA 分析来筛选组间差异物，发现每2 组之间均得到20 种以上差异成分，并选出莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷、没食子酸、阿魏酸、马钱苷酸、绿原酸、藁本内酯、5-羟甲基糠醛9 种差异大、含量高、药理活性和紫外吸收强的代表性成分进行含量测定。OPLS-DA 分析、聚类热图分析均显示，炮制品组、酒萸肉组中各成分含量变化趋势极为相似，表明酒萸肉的加入对增加组方配伍合理性起到主要贡献； 炮制品组中有机酸、环烯醚萜苷总量略高于酒萸肉组，推测酒当归的加入也具有一定协同增效作用； 炮制品组中各饮片相互配伍后有机酸总量显著升高，但环烯醚萜苷类成分含量未明显降低，与山茱萸酒制后莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷等环烯醚萜苷类成分含量显著降低的趋势不同［10］。另外，酒当归、酒萸肉的加入对组方成分的影响可能与黄酒有关，该辅料可使加味拱辰浓缩丸中当归、山萸肉等饮片中有机酸类成分溶解度增加，含量升高，进一步改变了溶液pH［36］，从而影响环烯醚萜苷类成分酸解效率，还可提高该类成分前体物质向环烯醚萜苷类物质的转化效率［37］。

3.2 成分-药效关联分析 中医认为，早发性卵巢功能不全病机主要与肾、肝、心等脏腑有关； 西医认为，本病主要发病机制与神经内分泌、免疫功能、卵巢微环境、细胞自噬与凋亡等因素有关［2］。加味拱辰浓缩丸主要成分包括有机酸类、环烯醚萜苷类等，具有保护神经系统、促进造血功能、保肝、免疫调节、降血糖等作用，集中作用于神经系统、内分泌系统、免疫系统［34，38］，与早发性卵巢功能不全发病机制吻合，也与中医“肾” “肝”藏象在宏观层面所指一致［35，39］。由此推测，加味拱辰浓缩丸所含有机酸、环烯醚萜苷类成分含量的升高可能会增强其补益肝肾作用，从而提高疗效。

4 结论

本实验通过化学成分种类、数量、含量对不同组成的加味拱辰浓缩丸质量进行综合评价，发现炮制品组、酒萸肉组质量优于生品组、酒当归组，表明酒萸肉的加入对增加组方配伍的合理性起到主要贡献，并且酒当归的加入具有一定协同增效作用。