UPLC-MS/MS 法同时测定小绿叶止咳糖浆中8 种成分的含量

卢薇薇，苏 丹，彭 秘，刘匡一

（1.江西中医药大学第二附属医院，江西 南昌 330000； 2.江西中医药大学中医药防治认知障碍脑疾病江西省重点实验室，江西 南昌 330000； 3.中国人民解放军联勤保障部队第908 医院，江西 南昌 330000；4.南昌市第一医院药剂科，江西 南昌 330000）

小绿叶止咳糖浆为德国Engelhard 制药公司开发的纯天然药物，主要成分是常春藤叶干提取物，用于缓解小儿感冒等各种病因引起的咳嗽，舒缓咽喉肿胀，能有效对抗可能转化的严重支气管炎症［1］。前期课题组从小绿叶止咳糖浆中共鉴定出62 种成分［1］，主要为黄酮类、酚酸类、皂苷类，其中皂苷类的常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷，黄酮类的芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷，以及酚酸类的绿原酸等均对呼吸道系统疾病具有一定作用［2-6］。但预实验发现，秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷含量太低，传统的HPLC 法无法满足其含量测定要求。

UPLC-MS/MS 法作为灵敏度较高的检测方法，适用于含量低、成分复杂的样品检测。因此，本实验采用该方法同时测定小绿叶止咳糖浆中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸的含量，以期为该制剂质量评价提供参考，也为其后期药动学、药效物质基础研究提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器 超高效液相色谱系统（日本岛津公司）； AB SCIEX 5500 三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX 公司）； TC-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）； VORTEX-6 涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）； AL104 分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； DCY-24S 恒温氮气吹干仪（青岛海科仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸对照品（批号110753-201415，纯度≥96.2%） 购于中国食品药品检定研究院； 芦丁（批号B20771）、常春藤皂苷C （批号B20163）、常春藤皂苷B （批号B20166）、α-常春藤皂苷 （ 批号 B21958）、秦皮甲素 （ 批号B20989）、金丝桃苷（批号B20631）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号B21133） 对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98.0%。小绿叶止咳糖浆 （德国 Engelhard 公司，批号 19F059A、19L051A、20D095A、21N069A） 购于网络购物平台天猫国际自营店。甲醇、乙腈为色谱纯，均购于美国Thermo Fisher 公司； 甲酸为质谱纯，购于美国Sigma 公司； 水为蒸馏水，购于广州屈臣氏食品饮料有限公司。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 取100 μL 药液，置于10 mL 量瓶中，加50% 乙腈至刻度，超声处理30 min，50%乙腈补足减失的质量，取适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，16 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2 对照品溶液制备 取常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸对照品适量，80%乙腈溶解稀释，制成质量浓度分别为1 169、181、159、118、152、150、192.5、142 μg/mL 的溶液，即得，4 ℃下冷藏保存。

2.3 阴性样品溶液制备 按说明书添加工艺，制成缺常春藤提取物的纯糖浆空白制剂，按“2.1”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流动相0.05%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～1.5 min，5% B；1.5～5 min，5% ～40%B； 5～10 min，40% ～90%B；10 ～11 min，90% B； 11 ～11.1 min，90% ～5% B；11.1～12 min，5%B）［7-13］； 体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃； 进样量1 μL。

2.5 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子扫描； 正离子电压5 500 V，负离子电压-4 500 V；Gas 1/Gas 2 50 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； Cur Gas3 5 psi，其他参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 图1 ～3 显示，各成分色谱峰峰形理想，空白无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 阴性样品多反应监测色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of negative samples

图2 对照品多反应监测色谱图Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of reference substances

图3 供试品多反应监测色谱图Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of test samples

2.6.2 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量，乙腈稀释成不同质量浓度，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并分别以S/N ＝10、3 为定量限、检测限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度试验 取“2.2” 项下对照品溶液适量，选择中间质量浓度，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定7 次，测得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸峰面积RSD 分别为 2.31%、2.17%、2.28%、3.58%、2.03%、3.01%、2.85%、2.76%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性试验 取“2.1” 项下供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.4”“2.5” 项条件下进样测定，测得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸峰面积RSD 分别为 2.79%、3.22%、2.67%、3.88%、2.56%、3.42%、3.06%、2.98%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.5 重复性试验 取“2.1” 项下供试品溶液适量，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定7 次，测得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸峰面积RSD 分别为2.33%、2.16%、2.54%、3.15%、3.52%、3.11%、2.92%、2.73%，表明该方法重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验 取药液 （批号21N069A） 50 μL，加入常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸质量浓度分别为1.67、1.81、1.59、1.18、1.52、1.50、1.93、1.42 μg/mL 的“2.2” 项下对照品溶液100、200、500 μL，按“2.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.4” “2.5” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸平均加样回收率分别为98.11%、96.72%、99.48%、100.13%、101.28%、96.61%、98.12%、98.54%，RSD 分别为2.19%、3.42%、3.67%、2.48%、2.11%、1.78%、3.82%、2.66%。

2.6.7 样品含量测定 取3 批样品，按“2.1”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在 “2.4”“2.5” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（μg/mL，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （μg/mL，n＝3）

3 讨论与结论

在色谱柱方面，课题组前期定性研究时采用T3 柱，目的是将小绿叶止咳糖浆中极性偏大或偏中性的成分更好地进行分离。本实验所测成分大多为极性偏小的黄酮类和皂苷类，故最终选择C18色谱柱。

在流动相方面，本实验通过正负离子同时扫描的方式进行数据采集，水相考察了0.1%、0.05%甲酸，综合化合物响应情况，最终选择0.05% 甲酸-乙腈体系。

MRM 图显示，3.01 min 为绿原酸出峰时间，2.33、3.41 min 出现相应峰信号。根据前期定性分析数据，可知存在新绿原酸、隐绿原酸同分异构体，通过二级确证，推测2.33 min 处为新绿原酸，3.41 min 处为隐绿原酸，根据参考文献［14-20］结构相似定量报道，以绿原酸为对照品对两者进行含量测定，结果分别为19.64、4.80 μg/mL。

本实验首次建立UPLC-MS/MS 方法同时测定小绿叶止咳糖浆中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、芦丁、秦皮甲素、金丝桃苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、绿原酸的含量，该方法专属性强，灵敏度高，分析时间短，可为该制剂质量标准研究提供参考，并能为其后期药动学、药效物质基础研究提供数据支撑，从而为相关临床合理用药奠定基础。