不同来源外泌体对缺血性脑血管病的治疗作用研究进展

高天池，宁丹丹，周哲屹

(1.广西中医药大学,广西 南宁 510120;2.柳州市中医医院神经内科,广西 柳州 545002)

缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)可由多种病因引起,包括动脉硬化、血管炎等,好发于中老年人,具有发病率高、致死率高、致残率高、复发率高及经济负担高的特点。近年来,脑卒中及其亚型发病率增长迅速,其中缺血性脑卒中增幅最大[1]。ICVD患者往往由于脑血管堵塞造成脑血流量减少和脑损伤,持续的时间越长,脑损伤就会越严重,虽然存活神经元的功能可以部分代偿缺血后的脑损伤,但人脑神经元的修复能力有限[2]。在ICVD的临床治疗中,溶栓和血管内介入治疗是相对有效的方法,但溶栓治疗有严格的时间窗口,绝大多数患者入院时已经失去了溶栓治疗的时机[3]。此外,ICVD相关治疗药物穿越血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的能力极低,因此,尚无治疗ICVD十分有效的策略,寻找新的治疗靶点对ICVD的治疗具有重大意义。外泌体于1983年首次在体外培养的绵羊红细胞上清液中被发现[4]。外泌体具有直径小和可以穿过BBB到达脑组织的特性[5]。有研究表明,外泌体治疗具有增强神经发生、血管生成和轴突生长等作用,从而促进脑卒中后的神经功能恢复[6]。用于治疗ICVD的外泌体主要来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)、脑细胞、内皮细胞等,通过介导细胞通讯对脑损伤发挥治疗作用。不同来源的外泌体在ICVD治疗中的作用及相关机制不同。本文就MSC、脑细胞、血液、内皮细胞、巨噬细胞来源的外泌体治疗ICVD相关研究进展进行综述,以期为外泌体更好地应用于ICVD的治疗提供参考。

1 MSC来源外泌体

MSC是来源于中胚层的细胞,具有自我更新和多向分化的能力,并且具有转化为内皮细胞、神经胶质细胞和神经元的潜能,从而补充受损的病变细胞,提高神经学功能,改善患者的生存状态,是神经修复和再生的理想细胞。MSC可分泌生长因子、细胞因子、调节肽、特异性活性因子等,外泌体是MSC旁分泌的因子之一。目前研究较多的MSC来源的外泌体主要取自骨髓、脂肪、脐带等组织,少部分来源于尿液、羊水。

1.1 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)来源外泌体

BMSC来源外泌体来源于机体骨髓,为发现最早、最常见的外泌体之一,BMSC来源外泌体对ICVD具有积极的治疗作用。LIU等[7]研究发现,BMSC来源外泌体可呈剂量依赖性地减少缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)大鼠脑梗死面积和脑含水量,改善神经功能,这可能与BMSC来源外泌体下调神经元上的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3和焦磷酸化相关蛋白有关,此外,BMSC来源外泌体可促使I/R损伤诱导的M1型小胶质细胞向M2表型转变。GAN等[8]将BMSC来源外泌体注射到大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)诱导的神经元损伤小鼠,并将BMSC来源外泌体与暴露于氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的N2a细胞进行体外培养,结果发现,外泌体可减轻MCAO/R诱导的神经元损伤小鼠的海马神经元损伤和OGD/R诱导的N2a细胞损伤,其机制与外泌体中微RNA(microRNA,miRNA)-455-3p靶向调节凋亡相关蛋白7表达有关。LI等[9]研究发现,BMSC来源外泌体可改善MCAO大鼠的神经功能和病理变化,减缓神经元凋亡并降低炎症因子水平,这是因为BMSC外泌体中的miR-150-5p 可通过抑制Toll 样受体5对I/R脑损伤发挥保护作用。HU等[10]研究发现, BMSC来源外泌体可显著改善脑缺血小鼠的神经功能,减少脑梗死体积,增加微血管密度,上调miR-21-5p表达,提示BMSC来源外泌体可能通过上调miR-21-5p的表达来促进血管生成。综上,BMSC来源外泌体可能通过调节小胶质细胞极化、神经元上的炎症小体表达及外泌体中miRNA的靶向调节作用来减轻脑损伤。

1.2 脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell,ADMSC)来源外泌体

除BMSC外,来源于脂肪的MSC也能分泌外泌体,ADMSC来源外泌体具有分布广泛、易分离且成本低等优势,近年来引起研究者的广泛关注。KUANG等[11]将原代神经元暴露于OGD环境中并与ADMSC或ADMSC分泌的外泌体共同培养,结果发现,ADMSC或ADMSC分泌的外泌体均可显著减少神经元死亡,其机制为ADMSC通过分泌含有miR-25-3p的外泌体改善自噬通量,进而发挥神经保护作用。YANG等[12]研究发现,ADMSC来源外泌体可促进OGD处理的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)的迁移和血管生成,其机制与ADMSC来源外泌体作用于miR-181b-5p/瞬时受体电位通道7轴有关。为了验证异种ADMSC外泌体治疗的安全性与可行性,CHEN等[13]从迷你猪中提取ADMSC来源外泌体并注射到急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)大鼠模型中,结果表明,异种ADMSC来源外泌体治疗是安全的,并且可减少脑梗死区和改善大鼠AIS后的神经功能。JIANG等[14]研究发现,用ADMSC来源外泌体治疗AIS大鼠可显著减少脑梗死的损伤面积,其机制为,富含miR-30d-5的ADMSC来源外泌体通过抑制自噬介导的小胶质细胞向M1型极化从而预防脑损伤。综上,ADMSC来源外泌体在ICVD中具有治疗作用,可能通过促进血管生成、抑制细胞自噬等机制来改善AIS后的神经功能和脑损伤,且具有一定的安全性。

1.3 人脐带间充质干细胞( human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUCMSC)来源外泌体

hUCMSC来源外泌体能够进入缺血损伤部位,并且可在体内和体外被细胞内化[15]。ZHANG等[15]研究发现,hUCMSC来源外泌体中的miR-146a-5p 通过白细胞介素-1受体相关激酶1/肿瘤坏死因子受体相关蛋白6途径降低小胶质细胞介导的神经炎症反应,减少缺血性脑卒中小鼠脑梗死体积,减轻小鼠行为缺陷,并促进小胶质细胞活化。YE等[16]用脑梗死组织提取物来预处理脐带MSC,并将梗死预处理的脐带MSC来源外泌体注射到MCAO大鼠体内,结果发现,梗死预处理的脐带MSC来源外泌体可通过增强血管内皮重塑来促进大鼠脑卒中后的神经功能恢复。NALAMOL等[17]研究发现,标准培养条件下培养的hUCMSC来源外泌体并未改善大鼠脑卒中后的神经系统结局,但将标准培养条件下培养的hUCMSC和OGD条件下培养的hUCMSC共培养后获得的外泌体治疗脑卒中大鼠,可减少大鼠脑梗死面积和减轻同侧半球的肿胀程度,并保留神经功能。综上,在适当实验条件下,使用经过预处理的hUCMSC来源外泌体可减轻脑卒中后脑损伤并改善神经系统结局。

1.4 其他(尿液、羊水)MSC来源外泌体

人类尿液间充质干细胞(urine mesenchymal stem cell,UMSC)可以诱导分化为神经元,继而发挥神经修复、保护作用。LING等[18]研究发现,脑卒中大鼠静脉注射人类UMSC来源外泌体后,促进了大鼠的神经发生,并缓解了神经功能障碍;此外,人类UMSC来源外泌体可促进OGD/R后神经干细胞的增殖和神经元分化,原因可能为,外泌体中miR-26a对组蛋白去乙酰化酶6具有抑制作用。羊水是胎儿生长的保护液,主要由水、细胞和化学元素组成,其中羊水MSC具有巨大的治疗潜力,是用于再生和治疗的合适细胞源。CASTELLI等[19]研究发现,人羊水干细胞外泌体对脑卒中体外模型具有神经保护作用,其机制可能与人羊水干细胞来源外泌体分泌的miRNA活性有关。

2 脑细胞来源外泌体

脑细胞是构成脑的多种细胞的总称,主要包括神经元和神经胶质细胞。脑细胞来源的外泌体主要是来源于星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元。

2.1 星形胶质细胞来源外泌体

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型。PEI 等[20]通过建立小鼠中脑动脉闭塞模型使小鼠产生永久性局灶性缺血,并将星形胶质细胞来源外泌体经尾静脉注射到小鼠体内,结果发现,星形胶质细胞来源外泌体可增强中脑动脉闭塞小鼠神经元活力,并可通过抑制体内自噬改善神经元损伤。脑缺血预处理可增加大脑对严重缺血损伤的耐受力,为探讨其中的保护机制,XU等[21]将包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞在内的各种类型细胞暴露于亚致死OGD中,并收集条件培养基,再从中分离出外泌体,结果发现,经OGD预处理的星形胶质细胞来源外泌体可以被神经元吸收,并减轻OGD诱导的神经元死亡和凋亡,此外,高通量miRNA测序结果显示,OGD预处理的星形胶质细胞释放的外泌体中miR-92b-3p水平增加,原因可能为,外泌体介导的miR-92b-3p从预处理的星形胶质细胞穿梭到神经元,从而减轻OGD对神经元的影响,提示OGD预处理的星形胶质细胞来源外泌体可对脑缺血神经元发挥保护作用。DU等[22]研究发现,星形胶质细胞衍生的外泌体含有miR-17-5p,可通过抑制Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白2表达来保护新生大鼠免受缺血缺氧性脑损伤的影响。WU等[23]将星形胶质细胞来源的外泌体注射到I/R损伤的大鼠体内,结果发现,星形胶质细胞来源外泌体转运的miR-34c可通过靶向Toll受体7,抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(mitosin activates protein kinases,MAPK)信号通路,并减轻I/R引起的神经损伤。PEI等[24]将小鼠海马神经元细胞系HT-22在OGD条件下培养以模拟缺血性损伤,并从原代星形胶质细胞中分离出外泌体,结果发现,星形胶质细胞来源外泌体可通过转移miR-190b来抑制OGD诱导的自噬和神经元凋亡。综上,星型胶质细胞来源外泌体治疗缺血性脑损伤,可能与抑制自噬和神经元凋亡及外泌体分泌的miRNA活性有关。

2.2 小胶质细胞来源外泌体

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞,在脑部疾病中的脑稳态和神经保护中起着至关重要的作用,通过不断监视大脑环境以维持正常的大脑功能和稳态。ZHANG等[25]研究发现,小胶质细胞来源外泌体可被OGD处理的神经元内化,并可减少瞬时脑中动脉闭塞小鼠的脑梗死体积和行为缺陷,其机制可能为,外泌体通过转运miRNA-137来缓解神经元损伤。TIAN等[26]研究发现,白细胞介素-4极化的小胶质细胞可能通过分泌含有miR-26a的外泌体促进MCAO小鼠的血管生成,从而改善缺血性卒中引起的损伤。综上,小胶质细胞来源外泌体可通过减少神经元凋亡或促进血管生成来发挥神经保护作用。

2.3 神经元来源外泌体

神经元是神经系统中的基础结构和功能单位,是大脑中至关重要的细胞。神经元是不可再生的,并且神经元缺失和相关的脑功能减退密切相关。SONG等[27]研究发现,皮质神经元来源外泌体可通过分泌miR-181c-3p,下调缺血性脑损伤大鼠趋化因子(C-X-C基序)配体1表达,从而对抗大鼠星形胶质细胞中的神经炎症。但也有研究认为,OGD/R处理的皮质神经元来源外泌体对神经元起负面作用,CHIANG等[28]将大鼠皮质原代神经元细胞培养物置于OGD培养基中,然后分别从正常氧条件下和OGD/R条件培养基中收集神经元衍生的外泌体,结果发现,与来自正常氧条件下收集的外泌体相比,OGD/R条件培养基中收集的外泌体显著损害了皮质神经元细胞活力,并且减少了神经突起。综上,神经元来源的外泌体对ICVD的作用仍有待进一步研究证实。

3 血液来源外泌体

血液循环来源的外泌体是指从健康人或是ICVD患者的血液样本中提取出的外泌体,包括血清与血浆2个来源。通过分析血液来源外泌体内容物的变化(主要是miRNA表达的高低)可协助ICVD的诊断和预测预后。虽然血液来源的外泌体作为生物标志物可为ICVD的诊疗提供一定帮助,但目前仍处于起步阶段。

3.1 血清来源外泌体

ZHOU等[29]研究发现,与正常受试者的血清外泌体相比,AIS患者在脑卒中发作后24 h内血清外泌体中miR-134水平显著升高,此外,外泌体miR-134高表达与美国国立卫生研究院卒中量表评分、梗死体积呈正相关。XU等[30]研究发现,血清来源外泌体通过分泌miR-340-5p靶向 CD147,促进OGD诱导的 BMECs 的血管生成,从而对AIS脑发挥保护作用。SONG等[31]研究发现,AIS患者血清外泌体中miR-152-3p 表达显著低于健康受试者,从而推测,提高外泌体中miR-152-3p表达可能是预防和治疗AIS的一个策略。但也有研究对于血清外泌体的治疗作用持不同意见。YE等[32]从急性脑梗死患者中分离出血清外泌体,并注射到MCAO大鼠中,结果发现,急性脑梗死患者的血清外泌体通过miR-27-3p/过氧化物酶体增殖物激活受体γ轴加重了MCAO大鼠的脑损伤,使其行为恢复不良,并促进了脑部炎症的发生。因此,血清来源外泌体对ICVD的作用有待进一步的研究证实。

3.2 血浆来源外泌体

血液生物标志物用于诊断疾病是有效、经济和非侵入性的。LI等[33]研究发现,血浆外泌体中miR-422a 和 miR-125b-2-3p 可作为监测和诊断缺血性脑卒中患者的血液生物标志物,此外,血浆外泌体 miR-422a 具有更佳的诊断价值。LUO等[34]研究发现,大鼠血浆来源外泌体中miR-450b-5p可能与脑缺血有关并具有高诊断价值,可能成为大鼠短暂性脑缺血发作的治疗靶点。JIANG等[35]研究发现,血浆来源外泌体可促进热休克蛋白70在缺血区域的表达,抑制热休克蛋白70介导的活性氧产生,从而通过改善MCAO/R小鼠BBB的功能和预防线粒体损伤来缓解I/R损伤,提示血浆来源外泌体有作为治疗缺血性脑损伤的候选药物的潜力。综上,血浆来源外泌体及相关miRNA可能作为诊断ICVD患者的血液生物标志物,并具有一定治疗潜力。

4 内皮细胞来源外泌体

内皮细胞衍生的外泌体可参与血管的再生与修复,在ICVD的治疗和预后中起着重要作用。XIAO等[36]研究发现,内皮细胞来源外泌体可以保护神经细胞免受I/R损伤,其机制为:内皮细胞来源外泌体部分抑制了I/R诱导的细胞周期停滞和凋亡。ZHOU等[37]研究发现,将内皮细胞来源外泌体注射入MCAO模型鼠脑室内后可激活神经祖细胞的增殖和迁移,并且与磷酸缓冲盐溶液组(注射磷酸缓冲盐溶液)相比,细胞凋亡情况减弱,说明内皮细胞来源外泌体对急性缺血性损伤大脑中神经元血管单位的重建和保护至关重要。ZHANG等[38]分别从非缺血性大鼠和缺血性大鼠的脑内皮细胞(cerebral endothelial cell,CEC)中分离出nCEC-exos和isCEC-exos 2种外泌体,结果发现,该2种外泌体均能促进皮质神经元的轴突生长,且isCEC-exos对皮质神经元轴突生长的促进作用更强,其机制与受体神经元中的miRNA及其靶蛋白谱有关。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)是血管内皮细胞的前体细胞,当血管内皮受到损害时,EPC可分化为内皮细胞或通过旁分泌机制促进血管生成。HUANG等[39]用EPC来源外泌体治疗脑I/R大鼠,结果发现,EPC来源外泌体可通过抑制细胞凋亡和促进血管生成来缓解大鼠缺血性脑损伤。WANG等[40]将EPC转染了miR-126得到miR-126富集的EPC来源外泌体(EPC-EXosmiR126),并通过静脉输注治疗缺血性脑卒中小鼠,结果发现,EPC-EXosmiR126 在减少梗死灶大小、增加脑血流量和脑微血管密度、促进血管生成和神经发生以及神经功能恢复方面比EPC来源外泌体更有效,提示外泌体中miR126的富集可以减轻卒中后脑损伤和促进神经功能恢复。综上,内皮细胞和EPC来源的外泌体可能对于缺血性损伤大脑中神经元血管单元的重建及促进轴突生长至关重要。

5 巨噬细胞来源外泌体

XIAO等[41]研究发现,M2型巨噬细胞来源外泌体对OGD/R诱导的HT22神经元氧化损伤具有保护作用,其机制为,M2型巨噬细胞激活HT22神经元中核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路。另外,巨噬细胞来源外泌体可作为药物载体提高一些药物的生物利用度,促使药物更好发挥作用,还能保护经过OGD/R诱导的神经元氧化损伤。LI 等[42]研究发现,含有依达拉奉的巨噬细胞衍生外泌体可显著提高依达拉奉的生物利用度,延长半衰期,而且更容易到达永久性MCAO大鼠的缺血侧,并作用于神经元和小胶质细胞,从而减少神经元的死亡,促进小胶质细胞从M1型极化为M2型。

6 结论

ICVD为神经内科常见疾病,因其患病率高、致残率高等特点成为社会普遍关注的公共卫生问题。近些年来,外泌体作为新型治疗手段日益受到公众关注,其在ICVD的诊断、治疗中已经取得初步成果,总体来说MSC为其主要来源。外泌体对ICVD可能具有治疗作用,其作用机制可能归因于抗炎和抗氧化应激、减少细胞凋亡、抑制自噬、增强神经发生、促进血管生成和神经突起重塑等;骨髓干细胞来源外泌体侧重于减轻脑组织炎症来保护神经元;脂肪干细胞来源外泌体侧重于抑制自噬来保护神经;血液来源外泌体偏向于在疾病中作为潜在的治疗靶点和诊断生物标志物。但大部分研究局限于实验研究,而临床研究较少。目前,不同来源的外泌体在ICVD中具体的作用及相关机制尚未完全阐述清楚,使用外泌体治疗ICVD还存在全身给药后对脑缺血性病变的靶向性差的局限性。究竟是生理条件下还是病理条件下分泌的外泌体有治疗作用,这个问题仍需进一步探讨。虽然动物实验已经初步证实了外泌体治疗的安全性,仍需要大量实验来支撑应用于临床的安全性。总之,外泌体治疗ICVD尚处于初步阶段,仍需要继续结合先进医学技术继续深入研究,以期为外泌体更好地应用于ICVD诊治提供实验和临床支持。