乳腺癌中BACH 1、HO-1的表达及丹皮酚的调控研究①

杨芳芳,李睿慧,王建杰

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

目前,全球乳腺癌的发病率呈增长趋势,特别是在发展中国家。在中国,乳腺癌也是女性中最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。因此,进一步研究乳腺癌的分子机制并为其提供有效的治疗方案变得尤为重要。目前发现,BACH 1是一种转录抑制因子,它通过抑制HO-1的表达在氧化应激调节中起着重要作用。BACH 1在核内与HO-1启动子AREs紧密结合,从而抑制HO-1的表达。越来越多的研究表明BACH 1和HO-1在肠癌、肺癌、乳腺癌等癌症中的异常表达有助于肿瘤的转移[3,4]。丹皮酚是中药牡丹皮中的活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种活性。研究显示,丹皮酚对多种肿瘤的细胞增殖均具有抑制作用。先前研究表明,丹皮酚对EMT6乳腺癌小鼠和人MCF-7乳腺癌细胞具有抑制作用,可诱导细胞凋亡以及调节乳腺癌相关信号通路,其涉及了活化Caspase3和改善小鼠免疫功能等[5-7]。而丹皮酚的抗肿瘤作用是否通过调控BACH 1、HO-1的表达抑制乳腺癌细胞生长还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年9月至2018年7月在佳木斯大学附属第一医院和佳木斯市中心医院进行手术的114例女性乳腺癌患者所切除的癌组织和癌旁组织标本,并取得了患者知情同意和伦理委员会的批准。获得其临床病理学特征,包括年龄、淋巴结状态、肿瘤分级和肿瘤转移分期(TNM)。患者均为女性,年龄30～80岁,平均50.8岁。标本由114个乳腺癌组织和30个匹配的癌旁(对照)组织组成。肿瘤转移(TNM)分期标准参考世界卫生组织2005年确定的肿瘤分级标准。

1.2 实验试剂

MDA-MB-468细胞株(中国医学科学院肿瘤研究所);丹皮酚(沈阳药科大学);CCK-8试剂盒(碧云天生物公司);抗BACH 1、抗HO-1单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(Santa Cruz公司);β-actin抗体(Abcam公司);SDS-PAGE(弗德公司);光学显微镜及照相系统(Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法

将组织样本进行固定后石蜡包埋,然后切片处理。一抗BACH 1(1:50)、HO-1(1:100)孵育过夜。二抗孵育20min后,滴加SABC使二抗结合物增强。DAB显色,在光镜下观察并捕获图像。

1.3.2 细胞培养

将MDA-MB-468细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃,5%CO2的培养箱培养,隔天观察,适时传代。

1.3.3CCK-8检测丹皮酚对乳腺癌细胞增殖的影响

不同浓度丹皮酚处理MDA-MB-468细胞,接种于24孔板中培养,每组5个平行孔,48h, PBS清洗重复三次,将无血清的培养基和CCK-8按10∶1配制试剂,每孔加入100μL试剂,培养箱孵育2h后将上清液转移到96孔板中,每孔设置5个复孔,酶标仪450nm时测定吸光度OD值。

1.3.4Transwell法检测MDA-MB-468细胞的细胞迁移能力

无血清培养基轻柔重悬细胞(6×104个/mL),取200μL(0.2mL)稀释的细胞悬液于小室中。取600μL 20%完全培养基加至小室下方24孔培养板中,置于恒温培养箱中培养,用95%酒精固定,0.1%的结晶紫染色15min。显微镜下观察穿膜数并拍照。

1.3.5Westernblot检测MDA-MB-468细胞BACH1、HO-1的表达

提取细胞内总蛋白,按照BCA试剂盒步骤操作。转膜,封闭后加入抗体β-actin(1:1000)、BACH 1(1:1000)、HO-1(1:2000),4℃过夜。将膜放于二抗中摇床上孵育1h。TBST清洗后,成像系统观察蛋白条带,并导出图片。应用LabWork 3.0 UVP软件计算蛋白质条带强度。

1.4 统计学方法

采用SPSS25.0进行统计分析,两组间比较t检验,多组间比较F检验。临床参数使用χ2分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织中BACH 1、HO-1表达

BACH 1、HO-1在乳腺癌和癌旁组织中的表达情况,见图1。与对照组(图1A)相比,BACH 1(图1B)表达降低。HO-1与对照组相比表达升高(图1C、D)。

A.乳腺癌旁组织中BACH 1; B. 乳腺癌组织中的BACH 1;C. 乳腺癌旁组织中 HO-1;D. 乳腺癌组织中的 HO-1。数据来自每张玻片随机3～5个视野。

2.2 BACH 1、HO-1表达与临床病理参数之间的关系

在114例乳腺癌组织中,44例BACH 1高表达,70例低表达,HO-1 76例高表达,38例低表达。通过分析BACH 1、HO-1的表达情况与临床资料之间的相关性,结果发现BACH 1与肿瘤TNM分期显著相关,HO-1表达水平与肿瘤分级显著相关(P<0.05),见表1。

表1 BACH 1、HO-1的表达与乳腺癌临床病理参数的关系(%)

2.3 CCK-8法检测细胞增殖

不同浓度的丹皮酚处理MDA-MB-468细胞48 h,发现60mg/L的Pae对于乳腺癌细胞产生了显著的抑制作用(P<0.05,vs对照组),后续实验操作将用60mg/L浓度。

2.4 Transwell法检测丹皮酚处理MDA-MB-468细胞的细胞迁移能力

与对照组细胞相比,丹皮酚处理后细胞小室基底膜的细胞数目下降。因此认为丹皮酚,对乳腺癌细胞迁移能力有抑制作用,见图2。

A.对照组; B.丹皮酚组

2.5 丹皮酚对细胞BACH 1、HO-1蛋白表达的影响

应用Western Blot分析BACH 1、HO-1蛋白表达。与对照组相比,BACH 1表达上调,HO-1表达减弱,见图3。

A. Western印迹法以β-actin作为对照BACH1和HO-1的表达; B. 蛋白相对表达水平(n=3,表示±SD)*P <0.05对照。

3 讨论

本研究通过对乳腺癌患者癌组织与癌旁组织BACH 1与HO-1表达检测并分析其与临床特征的相关性,发现乳腺癌组织中BACH 1低表达,而非癌组织中只有20%BACH1低表达,并发现低BACH 1表达与肿瘤分期显著负相关。而HO-1高表达与肿瘤分级有关,低分化肿瘤HO-1表达高于高/中分化肿瘤。BACH 1为一种转录因子,在细胞周期中对很多基因进行负调控,在细胞凋亡和氧化应激反应中起着重要作用。可以被看作为肿瘤抑制因子。研究报道,BACH 1负调节HO-1的表达以抑制细胞凋亡并增加癌细胞增殖。BACH 1低表达促进乳腺癌进程。BACH 1的下调可能是由于血红素水平升高促使HO-1分解血红素而减少细胞凋亡[8,9]。HO-1是一种细胞保护酶,HO-1在多种肿瘤组织中高表达,包括乳腺癌、鼻咽癌和胃癌等[10,11],这与我们的研究结果一致,证明BACH 1低表达与HO-1高表达参与了乳腺癌的进程。

乳腺癌的治疗通常采用手术及术后的放、化疗等,通常容易复发和转移,中药以副作用小、价格低廉为患者提供了希望。丹皮酚是牡丹皮中的有效成分,具有抑制乳腺癌细胞生长的作用。本研究结果显示,丹皮酚能诱导细胞凋亡,细胞出现明显的凋亡形态学改变与凋亡指数的增加,并使低表达的BACH 1升高,高表达的HO-1降低,进一步证明了丹皮酚的抗乳腺癌的作用是通过诱导细胞凋亡,并且与调控BACH 1、HO-1相关,为以BACH 1、HO-1为靶点治疗乳腺癌提供了新思路。