基于高通量测序分析建曲发酵过程中微生物多样性变化△

谭斯尹，潘礼业，罗宇琴，李国卫*，陈向东，孙冬梅，张军

1.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；

2.广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

建曲始载于清代《药性考》[1]，产自福建泉州，又名泉州神曲、百草曲、范志神曲，其制作始于明、清年间，已有四百多年历史，清朝赵子敏、陈修园等名医均著书详述[2]。《本草纲目拾遗》曰：“建曲出福建泉州府开元寺造者佳，此由采百草号成，故又名百草曲……福建泉州府城内范志昊亦飞驰名万应神曲……店住学院考棚边桂坛巷内，观音亭顶南畔第三间，范志吴牌匾记。”[3]建曲有调胃健脾、消积进食、和中解酒、止泻利水的作用，常用于治疗四时不正之气、感冒发热、头眩咳嗽及伤食腹痛、痞满气痛、呕吐泻泄痢疾、饮食不进等症[3]。

根据《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》中建曲的制备方法，将广藿香、苍术、厚朴等23 味药与麦麸、面粉混匀后制成方块，经自然发酵后干燥而得[4]。从现代微生物学的角度，建曲的发酵过程实质是微生物生长、演替、互作和代谢的过程，通过微生物和酶的催化与分解，使药物发泡、生衣，微生物产生的次生代谢物、蛋白酶、消化酶和低聚糖等新的活性成分为建曲的功能药效提供了必要的支持；低聚糖、单糖等成分能协助肠胃发挥正常功能、预防胃炎和肠胃溃疡[5-6]。在历代《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）中，建曲均以“遍起白霉，有酒香气”为其发酵炮制终点的判断标准，人为主观因素影响较大，况且有些厂家为了美观会将建曲发酵终点提前，并未达到“遍起白霉”的发酵程度，无法保证用药安全[7]。此外，自然发酵由于不同时期的温湿度和发酵时长存在差异，造成发酵产物和微生物种类和数量不可控，导致同一产地不同批次或不同产地的建曲药效和品质存在差异。

利用优势菌种建立的发酵工艺，可改善自然发酵中杂菌多、时间长等不稳定性[8]。目前，关于建曲发酵菌群的研究较少[7,9]，尤其有关建曲中真菌的群落结构研究鲜有报道。因此，本研究参照《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》，以自然发酵条件下符合药用标准的建曲为研究对象，从发酵微生物角度进行定性表征，通过高通量测序技术，揭示了在同一发酵条件下，建曲发酵过程中微生物结构和功能的变化，以及优势物种，明确了建曲发酵中的主要功能微生物，为后续建立稳定可控的建曲现代发酵工艺提供参考。

1 材料

1.1 样品

建曲原料药材（辣蓼、苍耳草、青蒿、苦杏仁、赤小豆、麦芽、炒山楂、陈皮、广藿香、苍术、厚朴、川木香、白芷、槟榔、麸炒枳壳、紫苏、薄荷、谷芽、官桂、香附、甘草）来自广东一方制药有限公司，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，均符合《中国药典》2020 年版及《四川省中药材标准》2010年版的规定，样品信息见表1。

表1 建曲原料药材信息

1.2 试药

FastDNA ™ Spin Kit for Soil 试剂盒（批号：116560200-CF，MP Biomedicals 公司）；TransStart Fastpfu DNA 聚合酶（批号：AP221-01，TransGen公司）；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（批号：APGX-250，AXYGEN 公司）；TruSeqTM DNA Sample Prep Kit（批号：FC-121-3001，Illumina公司）。

1.3 仪器

Nanodrop2000 型微量紫外-可见光分光光度计（Thermo Scientific公司）；GeneAmp™ 9700型聚合酶链式反应（PCR）仪（Applied Biosystems公司）；Quanti Fluor™ -ST型蓝色荧光定量系统（Promega公司）。

2 方法

2.1 样品制备

参照《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》中建曲的制备方法[4]，除麦麸、面粉外，将其余辣蓼等21 味药材粉碎成细粉，与麦麸混匀，过三号筛，再将面粉制成适量稀糊，趁热与上述药粉揉合均匀，以手捏成团，掷之即散为宜，制成方块，块间留有空隙，上盖麻袋，药块置密闭室内自然发酵3 d（发酵结束点为72 h），至药块遍起白霉，有酒香气时取出，炕干。随后，分别在0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h 进行取样，每个取样时间点分别随机取3 个平行样品，用无菌手术刀切取样品2～3 g，切下的样品放置于-80 ℃下保存备用。

2.2 样品总DNA提取

建曲样品用FastDNA™ Spin Kit for Soil试剂盒进行提取，用Nanodrop2000型微量紫外-可见光分光光度计检测DNA的浓度和纯度，于-80 ℃保存。

2.3 Illumina MiSeq高通量测序

样品送至上海美吉生物公司进行高通量测序。基于Illumina MiSeq 测序平台，利用16S rRNA（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS（ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3'和ITS2R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3'）通 用引物进行双末端测。

2.4 数据分析

利用美吉生物云平台（https://www.majorbio.com/web/www/index）对样品序列按最小序列数进行抽平化后，利用QIIME 1.9.1 软件过滤低质量序列和去除嵌合体，获得有效序列。利用Usearch 11 软件对操作分类单元（OTUs）进行聚类，聚类标准为核苷酸序列相似度＞97%。利用Silva 数据库（http://rdp.cme.msu.edu/）和Unite数据库（http://unite.ut.ee/index.php）分别对每个OTU 的代表性16S rRNA和ITS 基因序列的分类学位置进行分析，置信阈值为70%。利用Mothur 1.30.2 软件对包括Shannon、Chao1和Good's coverage 在内Alpha多样性指数进行计算。用Canoco 5.0 软件进行细菌群落结构的非度量多维尺度分析（NMDS），并用ANOSIM/Adonis基于Bray-Crutis距离计算样品间群落组成的差异性。运用Wilcoxon 秩和检验分析组间物种丰度的差异。所有统计学分析均利用SPSS v25.0 软件计算，显著性水平阈值为P＜0.05。使用PICRUSt 1.1.0 软件对OTU 丰度表进行标准化，测序数据比对京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）对菌群代谢功能进行预测。

3 结果

3.1 物种注释

从30个建曲发酵样品DNA测序中共获得1 695 154条真菌有效序列，平均长度为232 bp，522 个OTUs（表2）；共获得1 563 314 条细菌有效序列，平均长度为414 bp，457 个OTUs（表3）。基于OTU 的Alpha 多样性分析可知，所有样品真菌和细菌的Good's coverage 分别为99.82%～100.00% 和97.04%～99.53%，表明测序数据可真实反映样本的微生物多样性。

表2 30个建曲发酵样品中真菌的Illumina测序数据统计分析（±s,n=3）

注：与0 h比较，*P＜0.05，#P＜0.01；表3同。

表3 30个建曲发酵样品中细菌的Illumina测序数据统计分析（±s,n=3）

表3 30个建曲发酵样品中细菌的Illumina测序数据统计分析（±s,n=3）

本研究通过Shannon 指数和Chao 指数来表示菌群的多样性和丰富度。在整个发酵过程中，建曲的真菌群落多样性（P＜0.05）和丰富度（P＜0.05）显著比细菌的高。发酵前24 h（0～24 h）的真菌和细菌群落多样性（P＜0.05）和丰富度（P＜0.05）显著比发酵后32 h（32～72 h）高。随着发酵时间推移，真菌群落多样性和丰富度呈下降趋势，而细菌群落多样性和丰富度则先降后升，表明了在建曲发酵过程中真菌和细菌群落存在明显演替现象。

3.2 建曲发酵过程中微生物群落结构特征

在属水平上（图1A），建曲真菌的优势类群为曲霉菌属（Aspergillus），占总真菌的36.57%。发酵前24 h，真菌群落组成变化较小，主要由曲霉菌属（平均相对丰度为17.21%）、链格孢霉菌属（Alternaria，10.82%）、镰刀霉菌属（Fusarium，8.87%）、枝孢菌（Cladosporium，7.17%）、赤霉菌属（Gibberella，5.33%）和节担菌属（Wallemia，4.84%）等真菌组成。自发酵后32 h，真菌群落结构发生较大的变化，曲霉菌属的相对丰度随着发酵时间延长而增加（49.49%，P＜0.05），而链格孢霉菌属（2.44%，P＜0.05）、镰刀霉菌属（3.34%，P＜0.05）、枝孢菌属（2.48%，P＜0.05）、赤霉菌属（1.67%，P＜0.05）等主要真菌类群的相对丰度则减少。

图1 属水平上建曲真菌和细菌的群落结构

对于细菌群落其变化趋势与真菌相似（图1B），细菌群落组成同样在发酵前24 h 变化较小，但种类较单一。建曲中主要由泛菌属（Pantoea）、魏斯菌属（Weissella）、红球菌属（Rhodococcus）、片球菌属（Pediococcus）和不动杆菌属（Acinetobacter）组成，其中泛菌属作为优势类群占总细菌的17.45%。发酵前24 h 的优势类群为泛菌属（24.32%）和红球菌属（29.65%），发酵后32 h 到结束，两者相对丰度下降（P＜0.05），分别占总细菌的12.87%和4.78%，但魏斯菌属（25.27%）、片球菌属（19.52%）和不动杆菌属（18.01%）的相对丰度明显增加，在发酵结束时，不动杆菌属成为绝对优势菌属，相对丰度达到36.71%。

在种水平上（图2A），建曲真菌的变化趋势与属水平相似，主要由溜曲霉Aspergillus tamarii、小菌核曲霉Aspergillus minisclerotigenes、unclassifiedAspergillus和unclassifiedAlternaria这4 种真菌组成。发酵前24 h，溜曲霉和小菌核曲霉均不是优势物种，但两者在合适的发酵条件下快速繁殖，在发酵后32 h 成为最优势菌群，分别占总真菌的22.30%和21.19%，而unclassifiedAspergillus（3.90%，P＜0.05）、unclassifiedAlternaria（2.41%，P＜0.05）、unclassifiedFusarium，（3.08%，P＜0.05）和Cladosporium delicatulum（2.21%，P＜0.05）等 真菌相对丰度则减少（P＜0.05）。

对于细菌群落（图2B），与属水平上的变化趋势相似。发酵前24 h，建曲细菌由红串红球菌Rhodococcus erythropolis（29.56%）和unclassifiedPantoea（23.02%）占主要优势。发酵后32 h，红串红球菌（4.69%，P＜0.05）和未分类泛菌属（2.57%，P＜0.05）相对丰度显著下降，而类肠膜魏斯 菌Weissella paramesenteroides、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus和约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii迅速成为优势类群，分别占总细菌的25.24%、19.52%和13.99%，发酵结束时约氏不动杆菌占24.84%，成为绝对优势菌。

基于OTU水平的NMDS分析可知（图3），发酵前24 h 的建曲真菌（P＜0.05）和细菌（P＜0.05）群落与发酵后32 h的群落分别沿第二轴和第一轴分开，且不同发酵时间的建曲真菌和细菌群落结构差异也有统计学意义（P＜0.05），这些聚类趋势与Alpha 多样性指数（表2、表3）、微生物群落（图1、图2）结果一致，说明了发酵时间的延长会导致建曲微生物群落结构变化。

图3 基于OTU水平的建曲真菌和细菌群落的NMDS分析

3.3 建曲发酵过程中微生物群落组成比较

通过韦恩图分析建曲不同发酵时期所共有和独有的OTU数目（图4）。从分析结果可以看出，10组建曲样品中真菌和细菌的OTUs 总共97 个和77 个，其中共有OTUs 数目分别为97 个和31 个。值得注意的是，真菌特有的OTUs 数为0 个，而细菌特有的OTUs 数为46 个，主要集中在发酵结束时，其特有的OTUs数为31个，其占细菌OTUs总数的40.26%。表明了尽管不同发酵时期建曲中的真菌的优势类群有所变化，但其菌群种类基本一致，而细菌种类则在发酵结束出现较大变化。

图4 不同发酵时期建曲真菌和细菌中共有的和特有的OTU数分析

3.4 建曲微生物群落功能预测分析

使用PICRUSt 对真菌进行功能分类有助于理解建曲在发酵中化学成分的转化过程。从图5 可知，真菌和细菌的功能代谢变化趋势与其群落结构变化一致。在整个发酵过程，真菌中具有氧呼吸代谢功能的类群占比最高（10.61%），细菌则是具有转运蛋白（transporters、ABC transporters）的类群最高（11.74%）。发酵前24 h，真菌和细菌的功能变化不明显。发酵后32 h，尤其在发酵56 h 到结束阶段，真菌中具有脂肪酸的β-氧化（fatty acid β-oxidation）功能、甲基酮生物合成（methyl ketone biosynthesis）功能、甘露糖生物合成（GDPmannose biosynthesis）功能、磷酸泛酸生物合成（phosphopantothenate biosynthesis Ⅰ）功能等相对丰度显著升高（P＜0.05）；而细菌主要是DNA 修复与重组蛋白（DNA repair and recombination proteins）、嘌呤代谢功能（purine metabolism）增加。在发酵40 h 时，细菌中有关氨基酸合成代谢活跃，如核糖体功能（ribosome）、DNA 复制蛋白（DNA replication proteins）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代谢（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）等功能的相对丰度均明显增加，这与类肠膜魏斯菌和红串红球菌相对丰度迅速上升有关。表明了建曲中含有丰富的代谢途径相关的真菌和细菌功能基因，而且不同发酵时间点部分微生物所发挥的功能也不同。

图5 真菌和细菌的基因功能预测热图

4 讨论

传统微生物分离技术是在特定的条件下利用培养基对微生物进行分离培养，方便直观，由于环境条件的改变和微生物的自然协作方式改变[10]，使得很多菌类无法培养，难以全面反映样品中整个微生物的结构情况，可能还会使得一些具有重要生物功能的微生物资源被忽视[11]。近年来，高通量测序技术已被国内外学者广泛应用到环境、生物、食品等微生物多样性研究中，也逐渐成为中药微生物资源研究的热门手段，如三七[12]、霍山石斛[13]、黄芪[14]等。本研究采用Illumina 高通量测序技术对发酵中建曲的真菌和细菌菌群进行鉴定，系统地揭示了建曲的微生物群落结构，初步了解建曲在发酵过程中菌群的变化与差异。

本研究共获得真菌和细菌的有效序列为3 258 468条，充分反映了建曲发酵过程中微生物群落结构。Alpha 多样性分析显示（表2、表3），建曲的真菌群落有较高的多样性和丰富度，与袁学刚等[15]对连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群的研究结果相似，表明建曲发酵过程主要由真菌主导。群落结构分析（图1）显示，建曲中的真菌主要由曲霉属组成，细菌主要由泛菌属、魏斯菌属、红球菌属、片球菌属和不动杆菌属组成，与廖茜[9]的研究结果不同，其发酵中的建神曲主要由乳杆菌Lactobacillus、绿脓杆菌Pseudomonas、芽孢杆菌Bacillus、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas等12 种细菌属组成，可能是由于建曲原料带有的菌种和发酵环境的不同，导致获得的微生物类群也不同。在发酵前24 h 的真菌和细菌种类均比发酵后32 h 多，进入发酵阶段后优势菌群逐渐显现（图1、图2），这与陈彦琳等[5]的研究结果一致，反映了发酵初期建曲原料中营养物质丰富，各类群处于均衡状态，自带的物种多样性较高。到了发酵中后期，营养物质开始减少，各类群开始掠夺养分，种内外斗争激烈，且建曲中的辣蓼、苍耳草、青蒿等药材有抑菌作用，这些药物成分在发酵过程中对微生物存在自然选择作用，使得整个发酵过程存在明显的菌群演替现象。

本研究发现建曲中有较多真菌具有降解生物质的能力，如镰刀菌属能产木质纤维素降解酶[16]、根霉菌属具有极强的蛋白质分解能力[17]等。其中，真菌的优势类群为曲霉属，其微生物分泌酶系最广泛，是目前酶制剂生产和工业发酵的最主要菌株，提高了发酵物中大分子物质向小分子物质的转化速度[18]。而其中的优势物种为溜曲霉和小菌核曲霉，溜曲霉属于壳霉目（Discellaceae）杯霉科（Aspergullus）曲霉属，主要生长在腐霉物、土壤、塑料管等各种不同基质上[19]。目前，关于溜曲霉和小菌核曲霉的次生代谢产物的研究较少，溜曲霉的代谢产物主要为生物碱和环肽类化合物，从浮木中的溜曲霉分离得到的五环辛吲哚类生物碱具有Ca2þ-ATPase 抑制活性、组蛋白去乙酰化酶抑制活性和对藤黄微球菌Mycrococcus luteus的抗菌活性[20]；与药用植物内共生的溜曲霉的活性物质主要为吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物，该生物碱家族中具有很多抗肿瘤活性的天然产物，对肿瘤细胞的增殖有抑制作用[21]。此外，溜曲霉具有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等多种酶系统，可通过纤维素产生蛋白[22]，而建曲中含有大量的纤维素，促进了该菌的生长和物质代谢，正因为溜曲霉和其他菌群的代谢产物功能多样，使得建曲发挥着多种治疗药效。由于建曲属于多药材混合发酵，含有多种活性物质，发酵中菌群结构的变化会对建曲中的药效成分产生不可避免的影响，且单一的特定菌种并不能达到混合菌种发酵的互补优势。后续可尝试利用优势真菌溜曲霉、小菌核曲霉、优势细菌约氏不动杆菌等菌种接种到建曲中，进行单独和混合发酵，减少杂菌生长，缩短发酵周期，考察建曲的活性物质和药效的变化，探索建曲质量和药效更为稳定的发酵工艺方法。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。