六味地黄汤对老化模型大鼠视网膜组织铁死亡通路的影响

张 琦,赵 磊,左 韬

0 引言

随着年龄的增长,机体会出现不可逆的衰老性改变,眼球是较早发生与年龄相关的退行性改变的器官之一,如视网膜衰老是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)的重要病因之一[1],如能减缓视网膜的衰老,就可以从源头上减少ARMD等年龄相关性眼病的发病率或减慢其病程进展[2]。铁死亡(ferroptosis)是一种程序性细胞死亡,以脂质过氧化、铁积累为特征[3],在衰老及其相关病理过程中发挥着重要调控作用,这也是衰老研究领域出现的崭新突破口,极大地推动了对于衰老及其相关疾病调控机制的深入研究。铁死亡相关调控分子同样对于衰老进程存在一定的调控作用。因此,本研究基于铁死亡途径研究六味地黄汤对老化模型大鼠视网膜的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物选取7-8周龄SPF级雌性SD大鼠45只,体质量200±20 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证编号:SCXK(辽)2020-0001]。饲养于SPF级实验室,屏障通风循环良好,室温20-25 ℃,湿度45%-55%,光照12 h/d。实验遵循相关规定,并通过动物实验伦理审查[批件号:2023CS(DW)-003-01],大鼠饲养期间均受人道对待。

1.1.2主要试剂及仪器

1.1.2.1主要试剂D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司,63004434),复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司,H20055546),谷胱甘肽(glutathione,GSH) ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,YJ531010)、铁蛋白(ferritin,FE) ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,YJ003262),兔抗鼠溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)抗体(上海优宁维生物科技股份有限公司,12691),兔抗鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)抗体(美国proteintech公司,67763-1-Ig)、兔抗鼠色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)抗体(武汉云克隆科技股份有限公司,PAB972Ra01),β-actin 抗体(美国SAB公司,21338)。

1.1.2.2主要仪器体表检测仪(东莞市微视康电子科技有限公司),石蜡包埋机(浙江益迪仪器有限公司,YD-6L),石蜡切片机(Leica,RM2245),石蜡冷冻台(浙江益迪仪器有限公司,YD-6D),摊片机(浙江益迪仪器有限公司,YD-A),烤片机(浙江益迪仪器有限公司,YD-B),普通光学显微镜(Nikon,Eclipse Ci-L),垂直电泳槽(BIO-RAD,JY-ZY5),化学发光成像系统(Tanon,5200Multi),多功能全波长酶标仪(BioTek,Epoch)。

1.1.3药品制备六味地黄汤组成为熟地黄24 g,山茱萸、山药各12 g,茯苓、泽泻、牡丹皮各9 g,均购自辽宁省中医院草药局,将药材用相当于药材5倍自来水浸泡2 h,武火煮沸后文火继续煎煮30 min,过滤收集煎液,原药渣加少量水继续煎煮,得二煎液;两煎液混合,浓缩至浓度生药含量为1 g/mL[4]。成人(60 kg)口服六味地黄汤的剂量为1.25 g/(kg·d)。通过人与大鼠等效剂量换算公式换算大鼠经口灌服六味地黄汤等效剂量为6.75 g/(kg·d)。

1.2方法

1.2.1模型建立及分组将45只大鼠适应性饲养7 d后,随机分成空白组(n=15)、模型组(n=15)、中药组(n=15)。模型组、中药组复制老化模型,即腹腔注射D-半乳糖[500 mg/(kg·d)],连续注射8 wk[5];空白组腹腔注射生理盐水[500 mg/(kg·d)]。同时,中药组灌服六味地黄汤[6.75 g/(kg·d)],空白组、模型组灌服等体积生理盐水,连续8 wk。

1.2.2眼底彩照及图像分析末次给药后2 h对各组大鼠行眼底彩照。具体方法:各组大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后散瞳(复方托吡卡胺滴眼液点眼,每次5-10 min,共3次),将体表检测仪镜头对准瞳孔,调整距离使电脑屏幕中眼底图片清晰,调整镜头角度,视盘位于屏幕中央,对焦后拍照。在MATLAB平台上运行视网膜自动图像分析(automated retinal image analyzer,ARIA)软件测量各组大鼠视网膜血管管径。在ARIA软件中打开以视盘为中心的大鼠眼底彩照图片,对距视盘边缘0.5-1.0个视盘直径范围内的所有血管进行自动分析,见图1。手动剔除不合格血管,按照血管直径由大到小的顺序将动脉和静脉分别排序,选取较粗的动脉和静脉各6条,分别将管径代入修正后的Parr-Hubbard公式[6]计算视网膜中央动脉管径当量(central retinal artery equivalent,CRAE)、视网膜中央静脉管径当量(central retinal vein equivalent,CRVE)。

图1 ARIA软件操作界面。

1.2.3HE染色采用HE染色法检测各组大鼠视网膜病理形态及厚度。大鼠实施安乐死后摘除右眼,FAS眼球固定液固定24 h以上,石蜡包埋,连续切片(厚度为4 μm),苏木素-伊红(HE)染色,应用光学显微镜观察视网膜形态,并采用Image J软件测量视神经旁2 mm处各层视网膜厚度。

1.2.4免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11、GPX4的表达。取石蜡切片,脱蜡,抗原修复液水浴20 min(100 ℃),取出放凉,PBS缓冲液洗涤3次,加3% H2O2,山羊血清封闭10 min,加一抗工作液(稀释比例1∶300)。隔日,4 ℃冰箱中取出后PBS缓冲液洗涤5次。加二抗工作液(稀释比例1∶500),水浴90 min(37 ℃)。重复冲洗过程,滴加DAB显色液,再次冲洗,苏木素复染(30-60 s),1%盐酸乙醇分化,自来水充分冲洗。晾干后中性树脂封片,采集并储存图像。

1.2.5Westernblot法采用Western blot法检测各组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11、GPX4的表达。大鼠实施安乐死后摘除右眼,解剖显微镜下将眼球沿角巩膜缘剪开,摘除玻璃体,内皮针固定,慢慢剥离出视网膜后将其剪碎、匀浆,裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心5 min,取上清液,进行蛋白定量,上样行SDS-PAGE电泳,转膜,加入100 g/L脱脂奶粉后室温封闭1 h,加入一抗(稀释比例1∶1000),4 ℃孵育过夜,洗涤,加入二抗(稀释比例1∶1000),室温孵育1 h,ECL发光与胶片曝光,扫描胶片,以β-actin为内参照物,测定目的条带、β-actin的灰度值,计算出两者的比值即该样本所测目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6ELISA法ELISA法检测各组大鼠视网膜组织中铁蛋白、GSH的表达。取视网膜组织上清液,按照试剂盒说明书检测各组大鼠视网膜组织中铁蛋白、GSH表达水平,用酶标仪测定450 nm处吸光度。制作标准曲线,按照标准曲线的公式,计算其与BCA蛋白浓度的比值。

2 结果

2.1各组大鼠眼底彩照及图像分析空白组大鼠眼底呈淡红色,自视盘向周围发出均匀的大血管,分支良好且延伸到视网膜周围;模型组大鼠较空白组视网膜变白,血管增多、收缩;中药组大鼠较空白组眼底颜色略变白,血管略有收缩,见图2A-C。与空白组相比,模型组、中药组大鼠CRAE、CRVE变小(P<0.05);与模型组相比,中药组大鼠CRAE、CRVE变大(P<0.05),见表1,图2D。

图2 各组大鼠眼底彩照及图像分析 A:空白组;B:模型组;C:中药组;D:各组大鼠CRAE和CRVE改变情况。白色箭头:视网膜变白;黄色箭头:视网膜血管收缩。aP<0.05 vs 空白组;cP<0.05 vs 模型组。

表1 各组大鼠CRAE和CRVE情况

2.2各组大鼠视网膜形态及厚度变化HE染色结果显示,空白组大鼠视网膜层次清晰,细胞排列整齐;模型组大鼠较空白组视网膜变薄,外核层(outer nuclear layer,ONL)、内核层(inner nuclear layer,INL)细胞减少;中药组大鼠较空白组视网膜略变薄,ONL、INL细胞略减少,见图3A-C。测量视神经旁2 mm处视网膜厚度,与空白组相比,模型组、中药组大鼠视网膜厚度、INL厚度、ONL厚度均变薄(P<0.05);与模型组相比,中药组大鼠视网膜厚度、INL厚度、ONL厚度均增厚(P<0.05);三组大鼠INL厚度占视网膜厚度百分比、ONL厚度占视网膜厚度百分比比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表2,图3D。

图3 各组大鼠视网膜HE染色情况 A:空白组;B:模型组;C:中药组;D:各组大鼠视网膜厚度改变情况。INL:内核层;ONL:外核层。aP<0.05 vs 空白组;cP<0.05 vs 模型组。

表2 各组大鼠视网膜厚度改变

2.3各组大鼠视网膜组织中PEDF和SLC7A11及GPX4蛋白表达水平免疫组织化学染色结果显示,与空白组比较,模型组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11、GPX4蛋白表达程度降低(P<0.05),中药组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11、GPX4表达程度降低(P>0.05);与模型组比较,中药组大鼠视网膜组织中SLC7A11、GPX4表达程度增高(P<0.05),PEDF表达程度略有增高(P>0.05),见图4、5,表3。PEDF于INL表达相对明显,SLC7A11于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)层表达相对明显,GPX4于ONL表达相对明显,证明视网膜在衰老中的不均等性,说明RPE、ONL是衰老视网膜发生铁死亡的关键部位。

图4 免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜组织中相关蛋白表达情况 INL:内核层;ONL:外核层;RPE:视网膜色素上皮。绿色箭头示PEDF/SLC7A11/GPX4蛋白阳性表达。

图5 免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜组织中相关蛋白表达水平 aP<0.05 vs 空白组;cP<0.05 vs 模型组。

表3 免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜组织中相关蛋白表达水平

Western blot检测结果显示,与空白组比较,模型组、中药组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达水平均降低(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠视网膜组织中PEDF、SLC7A11蛋白相对表达水平均升高(P<0.05),GPX4蛋白相对表达水平略有升高(P>0.05),见图6,表4。

图6 Western blot法检测各组大鼠视网膜组织中相关蛋白相对表达情况 A:Western blot检测结果;B:Western blot检测量化分析结果,aP<0.05 vs 空白组;cP<0.05 vs 模型组。

表4 Western blot法检测各组大鼠视网膜组织中相关蛋白相对表达水平

2.4各组大鼠视网膜组织中铁蛋白和GSH表达水平ELISA检测结果显示,与空白组比较,模型组大鼠视网膜组织中GSH表达降低(P<0.05),中药组大鼠视网膜组织中GSH表达略有降低(P>0.05),模型组、中药组大鼠视网膜组织中铁蛋白表达均增高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠视网膜组织中GSH表达增高(P<0.05),铁蛋白的表达略有降低(P>0.05),见表5,图7。

图7 ELISA法检测各组大鼠视网膜组织中铁蛋白和GSH表达水平 aP<0.05 vs 空白组;cP<0.05 vs 模型组。

表5 ELISA法检测各组大鼠视网膜组织中铁蛋白和GSH表达水平

3 讨论

半乳糖可致全身各系统发生氧化应激和线粒体损伤,模拟自然衰老大鼠所发生的改变,是成熟的用于诱导动物老化模型的药物[7]。关萍等[8]研究表明,小鼠连续49 d颈背部皮下注射D-半乳糖[5.12 mg/(g·d)]相当于自然生长的21月龄小鼠。根据公式9.125×小鼠日=1人类年[9]计算,此法诱导衰老小鼠相当于人类69岁。虽然本研究为大鼠,但根据小鼠衰老程度推断,本研究中造模方法可以达到大鼠的高度衰老期。衰老和氧化应激是ARMD的重要病因[10],与碘酸钠注射致ARMD模型相比,以D-半乳糖诱导的亚急性衰老动物模型用于研究ARMD,同时还兼具了衰老的因素,更符合ARMD的实际病理情况,因此该模型亦可作为ARMD模型[11]。年老体弱,肝肾不足,精血无以上注于目,视衣失养,神光不得发越,本方中熟地、山茱萸、山药可滋补肝肾。黄斑是视力最敏锐的地方[12],是目中神光发越的源泉[13]。学者邱礼新、陈达夫、李传课皆认为黄斑属脾[14-16],然本方山药、茯苓可补脾益气。杨华杰等[17]通过网络药理学及实验验证了六味地黄丸具有延缓衰老的作用。研究表明,铁死亡能够调控衰老进程,由此本研究提出假说,即基于调控铁死亡研究六味地黄汤对老化模型大鼠视网膜的保护作用机制。

对于D-半乳糖诱导的老化模型大鼠视网膜衰老程度的模型评价主要包含:(1)眼底彩照观察眼底。本研究结果显示,模型组大鼠视网膜变白,血管增多、收缩,与方越等[18]和董伟华等[19]研究中ARMD大鼠模型眼底彩照表现相近。ARIA软件是一个免费的开源软件,可自动识别血管并分析其平均直径,具有良好的重复性和再现性[20]。本研究结果显示,模型组大鼠视网膜CRAE、CRVE均变小,与王爽等[21]研究中老年人视网膜血管直径5 a变化的队列研究得出的结论一致,说明随着年龄的增长,视网膜动静脉血管均出现逐渐变细的趋势。(2)HE染色检测视网膜病理形态及厚度。本研究结果显示,模型组大鼠视网膜总厚度及INL、ONL厚度均明显变薄,但INL、ONL厚度占视网膜总厚度的构成比基本不变,与孙兆霞等[22]研究结果一致,说明衰老引起大鼠视网膜总厚度及各层厚度不同程度的变薄。(3)免疫组织化学染色法和Western blot法检测视网膜组织中PEDF的表达。结果显示,模型组大鼠视网膜组织中PEDF表达下调。PEDF广泛表达于眼、脑等组织中[23]。眼内PEDF主要由RPE以旁分泌的方式分泌至感受器间质[24],在视网膜分化中发挥重要作用。PEDF被称为“年轻”蛋白质,其原因是老年人较青年人视网膜中PEDF表达明显下调[25],或致视网膜发生与衰老相关的变化。PEDF降低可能是RPE氧化损伤和年龄增加的直接结果[26]。以上均说明老化模型大鼠视网膜衰老造模成功。经六味地黄汤治疗后,中药组较模型组上述模型评价指标均得到一定的改善,说明六味地黄汤对缓解视网膜衰老起到一定的作用。

本研究结果表明,模型组较空白组大鼠视网膜组织中铁蛋白表达增高(P<0.05),GSH、SLC7A11、GPX4表达降低(P<0.05)。近年提出铁衰老概念,即认为衰老和铁积累之间存在恶性循环[27]。铁蛋白与体内储存铁含量呈正比。随着年龄的增长铁会逐渐积累[28],铁稳态的失衡与年龄相关疾病存在关联。与年轻人相比,老年人体内的铁水平增加2倍[29],RPE内的铁水平增加3倍[30],视网膜内的铁水平增加1.3倍[31]。因铁超负荷而产生氧自由基可以引起视网膜毒性,铁通过Fenton反应催化生成不稳定的羟自由基,参与多不饱和脂肪酸的脂质氧化,产生共轭二烯,导致生成脂质过氧化产物,使细胞功能减退,促发铁死亡。SLC7A11是调控“铁过载-铁死亡”的关键基因,铁离子通过ROS-Nrf2-ARE轴上调SLC7A11的表达,SLC7A11能抑制铁过载引发的铁死亡[32]。铁死亡的主要下游调控因子GPX4是铁死亡的“门控蛋白”,是铁死亡研究领域的明星分子。GPX4通过将脂质氢过氧化物转变为类脂醇,抑制脂质活性氧的形成,从而减轻脂质过氧化,抑制细胞铁死亡的发生。因此,GPX4含量降低会使细胞脂质过氧化水平增加,进而发生铁死亡[33]。GSH是GPX4催化反应的底物,GSH耗尽引起GPX4失活,造成活性氧(ROS)积累,诱导铁死亡。细胞内GSH和GPX4水平均受SLC7A11影响[34]。本研究结果表明,中药组较模型组大鼠视网膜组织中GSH、SLC7A11表达增高(P<0.05),说明六味地黄汤可通过影响老化模型大鼠视网膜组织中GSH、SLC7A11的表达调控铁死亡途径进而达到保护视网膜老化的目的。

作用于铁死亡的药物有望成为防治视网膜老化的新方案。质膜丧失完整性、细胞质和细胞器肿胀、染色质浓缩是铁死亡的形态学特征,在超微结构水平表现为线粒体萎缩、嵴减少或消失、膜密度增加[35],因此,未来研究会应用透射电子显微镜观察老化模型大鼠视网膜的超微结构变化情况,进一步从形态学角度证实视网膜老化与铁死亡的相关性。