基于网络药理学和分子对接探讨尿C方治疗IgA肾病作用机制

张涤，李慧洁，邓跃毅

上海中医药大学附属龙华医院，上海 200030

IgA 肾病（IgAN）是一种自身免疫性疾病，是肾小球肾炎的最常见原因[1]。可发病于任何年龄，但发病高峰期为20～30 岁[2]。在IgAN 中，肾小球因肾脏中IgA 复合物的沉积而受损，逐渐损坏肾脏导致慢性肾炎持续进展，最后进展到需要透析或肾移植的终末期肾病，是非糖尿病成人特发性肾病综合征的最常见原因[3]。大多数患者表现为单发性或发作性肉眼血尿，或是在常规尿液检查发现镜下血尿和（或）蛋白尿。从无症状血尿和蛋白尿到肉眼血尿，并迅速进展为肾功能不全。

IgAN 属于中医学尿血、水肿、肾风、虚劳等范畴，病机为本虚标实，本虚多为气虚、阴虚或阳虚，标实包括风热、湿热、热毒、瘀血等。尿C 方为陈以平教授创立的经验用方——上海中医药大学附属龙华医院肾内科协定方，广泛运用于治疗IgAN，其由黄芪、川芎、葛根、黄精和杜仲5 味中药组成，有益气活血、健脾补肾的功效。本研究通过网络药理学方法确定尿C 方和IgAN 的靶点，构建药物-成分-靶点网络，鉴定关键活性化合物，建立PPI网络，鉴定枢纽基因。并进行了GO 和KEGG 富集分析，以探索共同靶点的信号通路和生物学功能。利用分子对接技术验证了所选活性物质与靶点的结合，为后续尿C 方治疗IgAN 的研究提供了依据。

1 资料与方法

1.1 尿C 方药物活性成分筛选利用中药系统网络（TCMSP；https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库筛选尿C 方药物的活性成分[4]。根据药代动力学参数：吸收、分布、代谢、排泄（ADME）、生物口服利用度（OB）和类药性指数（DL），以OB≥30%和DL≥0.18 作为筛选活性成分的阈值[5-6]，筛选尿C 方的化学成分。

1.2 筛选尿C 方可能靶点从TCMSP 和Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）获得药物潜在活性成分的靶标。然后，利用Uniprot（http：//www.uniprot.org/）蛋白质数据库中的UniProtKB 搜索功能用于标准化相关靶标的基因，物种设置为“人类”，状态设置为“已审查”[7]。在PubChem[8]（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索未找到有效靶点的活性成分的化学结构，选择Swiss ADEM，以GI absorption 值为HIGH，并且DL 中至少有两个YES 进行筛选[9-10]，利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）为筛选后的化学成分预测可能的基因靶点，将标准化后的靶点去重得到最终的药物靶基因。

1.3 药物-成分-靶点网络构建为了构建药物-成分-靶点网络，使用Cytoscape 3.9.1 软件（https：//cytoscape.org/）来连接活性成分及其相关靶标。然后，使用网络分析仪进行拓扑分析，以突出尿C 方在IgAN 治疗中的关键活性成分和靶点。

1.4 IgAN 靶点筛选IgAN 相关的靶基因是以“IgA nephropathy”为关键检索词从GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库[11]（相关性得分≥10）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）数据库[12]、人类在线孟德尔遗传（OMIM，https：//omim.org/）数据库[13]中收集。合并不同数据库的IgAN 相关靶标并去除重复项，得到IgAN 的潜在靶点。最后将潜在靶点在UniProt 上统一为基因名称。

1.5 尿C 方与IgAN 交集靶点通过Venn 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获得尿C 方和IgAN之间的交叉靶基因并进行鉴定和可视化。得到尿C方治疗IgAN 的交集靶点，并绘制韦恩图。

1.6 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建利用交互数据库平台“检索相互作用基因/蛋白质检索工具”（STRING）（https：//string-db.org/）[14]搜索药物-疾病交叉靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。在数据库检索中，设置蛋白质种类为“Homo sapiens”，去除孤立节点，置信度设置为0.9 以显示PPI 网络。之后，使用Cytoscape 3.9.1 软件对交互网络进行可视化[15]。

1.7 GO 分析和KEGG 通路富集分析DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库是一种全面的功能注释工具，它由一个全面的知识库和一组功能分析工具组成。不仅可以用于基因差异分析，还可以用于途径富集[16-17]。通过DAVID 数据库，对用于治疗IgAN 的尿C 方潜在靶标进行GO 和KEGG 富集分析，分析尿C 方治疗IgAN 的主要生物学功能。GO 分析包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF），根据P值大小，各取前10 位条目。KEGG 富集分析根据P值取前20 位富集结果。获得的数据由生物信息学（http：//www.bioinformatics.com.cn/）组织和可视化。结果以条形图和气泡图表示。

1.8 分子对接选取复方PPI 网络前15 个基因蛋白和“复方-活性成分-靶点”网络图前10 的活性成分，使用中药网络药理学分析系统TCMNPAS 以PSOVina 算法进行分子对接，计算蛋白与药物化学成分之间结合的亲和力及活性口袋位点。利用PubChem 数据库获得分子结构，从PDB 数据库中获得蛋白质结构。 采用Autodock Vina V1.1.2 软件（https：//vina.scripps.edu/）进行分子对接[18]，评估化合物与靶蛋白的亲和力。进一步利用PyMOL3.8 分析了对接结果的交互模式。

2 结果

2.1 尿C 方中药活性成分及靶点确定见表1。从TCMSP 数据库中检索到70 种尿C 方组成中药的潜在活性成分，筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18。使用SwissTargetPrediction 数据库进行成分补充。尿C 方一共含有5 种中药，其中黄芪、葛根、川芎、黄精和杜仲分别筛选出了20、4、6、12 和28 个成分。利用TCMSP 数据库和SwissTargetPrediction 数据库获取尿C 方中药活性成分1 363 个靶点，其中黄芪533 个靶点、葛根87 个靶点、川芎37 个靶点、黄精135 个靶点、杜仲571 个靶点，通过删除重复靶点和消除非活性靶点，最终获得该药物383 个潜在靶点。将其导入UniProt 数据库进行基因名称标准化。

表1 尿C 方药物有效成分

2.2 复方-成分-靶点网络构建见图1。为了更好地观察药物、成分和靶点之间的关系，使用Cytoscape 3.9.1 软件构建“复方-成分-靶点”网络图（图1），更直观地显示它们之间的关系。该网络图包含436 个节点和1 428 条边。通过Degree 值筛选出了其中前11 个关键成分，分别是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、异黄烷酮、脱氢二芷醇、类黄酮植物化学物、7-O-甲基异粘核醇、（-）-塔伯尼蒙坦宁、辛可南-9-醛，6′-甲氧基-（9R）-、黄芩素。

2.3 IgAN 相关目标预测结果以“IgA 肾病”为关键检索词，检索OMIM、DrugBank、GeneCards、DisGeNET 数据库。GeneCards 数据库一共找到1 593 个靶基因，排除Relevance score 小于2.4 的基因，得到796 个靶基因；DrugBank 数据库筛选出30 个靶基因；OMIM 数据库筛选出21 个靶基因；DisGeNET 数据库筛选出17 个靶基因。合并4 个数据库筛选得到的靶基因并进行重复数据删除，获得了823 个靶基因。

2.4 药物-疾病交集靶点见表2、图2。对383 个药物活性成分靶点和823 个IgAN 相关靶点进行维恩分析。两者相交后，得到111 个药物-疾病交叉靶点，绘制维恩图。

表2 药物与疾病交集靶点

2.5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和可视化分析见表3、图3。共将111 个常见药物疾病靶点输入STRING 数据库进行检索，构建蛋白质相互作用的PPI 网络。网络有111 个节点和431 条边，平均节点度数为7.77，平均局部聚类系数为0.463，PPI富集P值为＜1.0e-16。STRING 分析的结果被导入到Cytoscape 3.9.1 软件中，并使用网络分析仪进行拓扑分析。节点大小与度值呈正相关，节点度数越大，节点在网络中具有的生物学功能越多。根据Degree 值大小，连接最多的十个靶点是JUN、TP53、 AKT1、 MAPK1、 IL6、 PIK3CA、 TNF、CREBBP、MAPK14、CTNNB1。

图3 尿C 方与IgAN 交集靶点的PPI 网络

表3 尿C 方主要有效活性成分与IgAN主要靶点分子对接活性口袋定位

表3 PPI 网络中Degree 值前20 的靶点

2.6 GO 富集分析见图4、图5。利用DAVID 数据库和R 语言对111 个交集靶点进行GO 富集分析，共获得706 个生物过程（BP）、63 个细胞成分（CC）和123 个分子功能（MF）。图4 和图5 展示了GO 功能富集分析在生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）方面最显著的10 个结果。可以发现BP 涉及到细胞凋亡、炎症反应基因表达等；CC 涉及到细胞外空间、分子复合物等；MF 涉及到相同蛋白质结合、酶结合、酶活性等。

图4 尿C 方治疗IgAN 的GO 富集分析气泡图

图5 尿C 方治疗IgAN 的GO 富集分析条形图

2.7 KEGG 富集分析见图6、图7。111 种蛋白质进一步产生了161 条KEGG 通路，前20 条关键信号通路如图6、图7 所示，KEGG 通路富集分析确定了这些与机制相关的通路。结果显示尿C 方治疗IgAN主要与糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、脂质和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等密切相关。

图6 尿C 方治疗IgAN 的KEGG 富集分析条形图

2.8 分子对接见表3、图8、图9。分子对接是通过几何和能量匹配使分子与目标相互识别的过程。可以根据结合能值评估化合物和靶蛋白的结合强度和活性。负结合能值表明配体和受体可以自发结合。结合能值＜-5 kcal/mol 表明良好的结合活性，结合能值越低，对接效果越好。组分与蛋白质结合的区域称为活性口袋，IgAN 主要靶点与尿C 方主要有效分子对接的活性口袋定位见表3。表中x、y、z 代表IgAN 主要靶点与尿C 方主要有效分子对接的活性口袋定位参数，分子对接的过程涉及分子之间的空间形状互补和能量匹配，通过分子对接确定复合物中两个分子正确的相对位置和取向，研究两个分子的构象。在TCMNPAS 中进行分子对接亲和力分析，PPI 网络排名前15 的靶蛋白与尿C 方中前10 的有效活性成分分子对接结果表明槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、类黄酮植物化学物、黄芩素与MAPK1、MAPK14 结合较好，具有良好的结合亲和力。

图8 PPI 前15 个靶点与排名前10 的有效活性成分分子对接亲和力结果

图9 分子对接结果可视化

3 讨论

IgAN 其特征在于肾脏系膜区域的IgA、C3 或IgA 沉积[1，19]。根据牛津分类模型，其他病理类型的IgAN 特征包括系膜细胞增殖（M）、肾小球节段性硬化症（S）、毛细血管增生性病变、间质纤维化/肾小管萎缩（T）和新月体（C）的存在[20]。目前对IgAN 的治疗还是以优化支持治疗为基础，支持治疗包括优化生活方式、血压管理、肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断、评估并干预心血管事件风险[21]。对于肾功能迅速恶化的新月体IgAN 患者，可能需要口服皮质类固醇和环磷酰胺进行治疗[22]。

中药通常含有多种生物活性物质，具有多分子多靶点的优点，还可以根据患者的具体情况改变相容性，从而达到不同的治疗效果。这些特性使中药在治疗IgAN 方面具有巨大潜力。在IgAN 的临床治疗中，中药的活性成分通常作用于多种信号通路，主要具有抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，以及调节自噬[23]。

本研究应用网络药理学和分子对接技术，探讨尿C 方治疗IgAN 的作用机制。通过“复方-活性成分-靶点”网络构建，分析得出前11 个关键成分是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、异黄烷酮、脱氢二芷醇、类黄酮植物化学物、甲基异粘核醇、（-）-塔伯尼蒙坦宁、辛可南-9-醛，6′-甲氧基-（9R）-、黄芩素。槲皮素是一种广泛分布的生物活性类黄酮化合物，具有抑制多种疾病纤维化的潜力，研究表明[24]槲皮素减少了纤维化、炎症、氧化应激和细胞凋亡的面积，显著改善了HK-2 细胞中TGF-β1 诱导的EMT，增加双调蛋白（AREG）的表达。此外，槲皮素能抑制AREG 与EGFR 受体的结合，从而进一步影响其他下游途径，通过抑制AREG/EGFR 信号的激活来缓解体外和体内纤维化。在另外的一项研究中[25]，证实了槲皮素通过调节阻塞性肾病中的NLRP3 来改善肾小管间质转化和肾纤维化。Sheng H 等[26]研究表明山奈酚（KPF）在肾病的发展中具有促进自噬和抑制细胞凋亡的特性。山奈酚通过抑制NF-κB p65 和反式激活Nrf2 介导的抗炎和抗氧化作用来预防氯化镉（CdCl2）诱导的肾病[27]。除此之外山奈酚还有抗炎和抗动脉粥样硬化作用[28-29]。已有的临床和实验研究报道，β-谷甾醇（24-乙基胆甾烯-3-醇）是一种天然存在的植物甾醇，具有抗高血脂和抗高血糖特性[30]。类黄酮类化合物主要通过调节氧化应激反应和炎症反应来发挥治疗作用[31]。黄芩素与槲皮素均能减轻相关的氧化应激反应。由免疫复合物沉积引起的炎症反应发生在整个IgAN 过程中，各种炎症损伤引起防御反应，引发体内氧化应激，氧化应激引起细胞死亡可以激活炎症细胞[32-33]，肾损伤越来越严重最后导致肾衰竭。因此，抑制炎症反应和氧化应激是治疗IgAN 的重要因素。尿C 方中排在前几的有效活性成分大部分均有抗炎和抗氧化作用。

通过PPI 网络分析，JUN、TP53、AKT1、MAPK1、IL-6、PIK3CA、TNF、CREBBP、MAPK14 和CTNNB1可能是尿C 方治疗IgAN 的关键靶点。这些蛋白质被认为是核心蛋白质。而这些蛋白主要参与炎症、脂质和动脉粥样硬化、癌症的通路、氧化应激、细胞凋亡等。

MAPK14 调节AGE-RAGE 和癌症信号通路[34]。AKT1 参与炎症反应，有研究表示AKT1 缺失，会增加肾小管细胞凋亡和肾脏缺血再灌注损伤（IRI）期间的炎症反应，加剧肾脏损伤[35-36]。IL-6 和TNF 具有免疫调节和促炎作用[37]。IL-1、IL-6 和TNF-α 可诱导Th22 细胞分化和增殖，这些产生Th22 的TGF-β细胞被系膜细胞分泌的CCL20、CCL22 和CCL27 募集，促成肾纤维化[38]。结合KEGG 富集分析结果，发现这些核心蛋白质大多富集在AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等等。TNF 信号通路主要在于TNF-α，是IgAN 患者足细胞凋亡与蛋白尿相关的狭缝膈肌（SD）紊乱的主要参与者[39-40]，在IgAN的发病机制中起作用。AGE-RAGE 信号通路与自身免疫性疾病、炎症和组织损伤有关，晚期糖基化终末产物（AGE）抑制可减少肾病的炎症反应和氧化病变[41]。免疫复合物沉积、系膜细胞的活化和足细胞形态变化导致肾脏炎症反应[38]。尿C 方可以通过调控免疫相关细胞和炎症介质从而表现出对IgAN 的治疗作用。因此，尿C 方在治疗IgAN 方面具有巨大潜力。

为了更进一步验证核心蛋白能否与小分子稳定结合，笔者对前几个与IgAN 密切相关的关键靶点蛋白进行了分子对接研究。结果表明，MAPK1 和MAPK14 具有良好的结合尿C 方活性化合物的能力。

近些年来，网络药理学在中医领域得到了广泛的应用，从综合和系统的角度体现了中药复方对IgAN 治疗的多靶点、多途径、协同作用。本研究基于网络分析和分子对接技术，以尿C 方为研究对象，分析其化学成分、核心靶点和关键药效学成分的结合能力。初步探讨尿C 方治疗IgAN 可能产生的物质基础和作用机制。