基于网络药理学和分子对接探讨续断治疗骨质疏松性骨折作用机制

阮家坚，刘金城，蔡东岭，郭伟俊，魏其鹏，向振，董文暄，陈晓峰

1. 广州中医药大学，广东 广州 510006；2. 广州市番禺区中医院骨伤三科，广东 广州 511400

骨质疏松性骨折（OPF）是一种发生髋部、脊椎、肱骨及手腕等部位，以骨质减少、骨密度下降和骨代谢异常为临床表现的骨科疾病，严重影响患者日常生活。临床上OPF 主要治疗方案包括药物疗法、外科疗法、物理疗法，但这些治疗方法存在不良反应多、费用价格高昂等问题，不能从根本上改善骨代谢、恢复成骨与破骨进程的动态平衡[1-3]。续断是中国传统中药，其功效是补益肝肾、强筋骨。现代研究发现续断的主要成分是龙胆碱、β-谷甾醇等环烯醚萜类成分可通过增加成骨细胞的分化和活性，促进骨形成，抑制破骨细胞的产生，降低破骨细胞活性与限制骨吸收来减少OPF 的发生[4-5]。本研究通过网络药理学探讨续断治疗OPF 作用机制，并通过分子对接验证其结果，为后续研究续断治疗OPF 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 续断有效成分筛选和作用靶点获取采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-.com/tcmsp.php）获取续断的潜在活性成分，根据口服药物生物利用度（OB）≥30%和类药性指数（DL）≥0.18 为条件筛选续断有效活性成分[6-7]。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库对续断的活性成分进行标准化处理（将续断活性成分的靶点名称转换成基因名称）。

1.2 续断治疗OPF 的作用基因靶点筛选以“Osteoporotic fracture”为关键词，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）数据库中筛查OPF 相关的疾病靶点。利用Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）将OPF 疾病相关靶标和续断药物相关靶标进行交集，得到续断治疗OPF 共有的靶点信息。方案流程图见图1。

图1 续断治疗OPF 的网络药理学方案流程图

1.3 建立药物-成分-疾病-靶点网络利用Cytoscape软件（https：//cytoscape.org/）对获得的药物靶点和药物-疾病靶点进行可视化处理，构建出一个包含疾病、药物、成分以及药物-疾病目标在内的调控网络。

1.4 蛋白互作网络（PPI）构建利用STRING平台（https：//cn.string-db.org/）构建续断治疗OPF 的蛋白互作用网络，其筛选标准为种属选择人，最小互作分数值设定为0.4。

1.5 续断治疗OPF 作用靶点基因本体论（GO）以及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析通过Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）将中药-疾病靶点进行KEGG 通路和GO功能富集分析，以P值＜0.05 为筛查条件，根据靶标的富集度，对生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和通路进行降序筛选，最后数据进行可视化处理。

1.6 分子对接在TCMSP（https：//old.tcmsp-.com/tcmsp.php）数据库中获得1.1 中续断的潜在活性成分小分子的3D 结构的PDB 格式文件；在RSCBPDB（http：//www1.rcsb.org/）数据库获取1.4 中前5 位核心靶点的相互作用的蛋白PDB 结构。运用AutoDock 软件（https：//autodock.scripps.edu/）和 PyMOL（https：//pymol.org/2/）平台进行分子对接，计算核心靶点和活性成分结合需要的最低结合能，获得复合体的蛋白互作结构，利用PyMOL 对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 续断活性成分和作用靶点筛选结果见表1。从TCMSP 数据库中共得到续断的有效成分31 个，167 个相关靶点；通过OB 和DL 参数条件筛选出有效成分8 个，63 个有效靶点，通过Uniprot 数据库对63 个有效靶点进行标准化，共得到48 个作用靶点。

表1 续断有效活性成分信息表

2.2 续断治疗OPF 中药-疾病靶点和中药-成分-疾病-靶点网络调控网络构建见图2。通过Deepven网站的在线软件，将3 046 个OPF 疾病相关的靶点与48 个续断作用靶点进行交叉比较，共得到29 个续断治疗OPF 的中药靶点。中药续断主要通过5 种有效成分[龙胆碱、林生续断苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二邻咖啡酰奎宁酸、β-谷甾醇、谷甾醇]作用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP）3、β2-肾上腺素受体基因（ADRB2）、Bcl-2 相关X 蛋白（BAX）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（BCL2）、CASP8 等29 个靶点。

2.3 PPI 网络构建及核心靶点筛选结果见图3。续断治疗OPF 的靶点为CASP3、ADRB2、BAX、BCL2、CASP8、雌激素受体2（ESR2）、CASP9、二肽基肽酶-4（DPP4）、糖原合成酶激酶3（GSK3β）、异常凝血酶原（F2）、有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）14、碳酸酐酶2（CA2）、5-羟色胺受体2A（HTR2A）和一氧化氮合酶2（NOS2）等。

2.4 GO 富集分析结果见图4。经过GO 的解析后发现，这批交集的目标点主要包括参与细胞对有机环状化合物、激素、有机氮化物反应等BP；细胞组分主要有膜筏、膜微域和突触前膜的总体成分等CC；主要参与细胞凋亡执行阶段的半胱氨酸型内肽酶活性、内肽酶活性、G 蛋白偶联胺受体的活性、缩氨酸酶活性等MF。

图4 续断治疗OPF 的GO 富集分析图

2.5 KEGG 通路富集结果见图5。结果发现，差异蛋白主要富集在癌症通路、弓形体病、Kaposi 肉瘤相关的疱疹病毒感染、乙肝、大肠癌、小细胞肺癌脂质与动脉粥样硬化、雌激素等有关的信号通路。

图5 续断治疗OPF 的KEGG 通路富集分析图

2.6 分子对接结果见图6。选取PPI 网络的前5 靶标（CASP3、ADRB2、BAX、BCL2、CASP8）与续断的主要活性物质[龙胆碱、林生续断苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二邻咖啡酰奎宁酸、林生续断苷Ⅲ、臭山羊碱、威岩仙皂苷A_qt、β-谷甾醇、谷甾醇]配体受体分子进行分子对接验证。当2 个实体间的结合能量越低，表明两者之间相互作用的可能性越大。结果显示，（E，E）-3，5-二邻咖啡酰奎宁酸、龙胆碱、威岩仙皂苷A_qt 与ADRB2 的结合能分别是-10.7 KJ/mol、-8.5 KJ/mol、-8.5 KJ/mol；威岩仙皂苷A_qt 与CASP8结合能是-9.7 KJ/mol，β-谷甾醇与CASP3 的结合能是-9.9 KJ/mol。均小于-8.0 KJ/mol，具有较好的结合活性。可视化最佳构象图利用PyMOL 进行构图。

图6 分子对接结果图

3 讨论

中医将OPF 属于骨痹、骨痿、骨枯范畴，结合现代医学研究，认为OPF 的发病机制是由于多虚多瘀导致，在治疗上应以补肝肾、续折伤、活血化瘀为主[8]。续断有“续折接骨”的美誉，不仅可以补益肝肾，还可活血化瘀。本研究发现续断的主要成分为环烯醚萜类，其中龙胆碱、β-谷甾醇等活性成分是治疗OPF 的潜在核心成分。研究发现环烯醚萜类可以通过降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-6 的含量来提升骨小梁的密度和厚度，减少破骨细胞的活动性，改善骨代谢异常状态，进一步加快骨折的愈合[9]。陈文锦等[10]发现龙胆碱通过降低炎症因子TNF-α、IL-6 的水平改善大鼠体内炎症，通过调控相关炎症通路改善骨代谢异常状态。研究发现β-谷甾醇化合物能够通过MAPK 信号通路降低TNF-α 含量，有效抑制破骨细胞的分化[11]；β-谷甾醇还可通过CASP3、ESR1、肉瘤病毒、MAPK1 和MAPK14 等关键靶点激活动脉粥样硬化和MAPK 信号通路，减轻绝经后骨质疏松症症状[12]。

本研究表明，续断的主要有效成分可通过多个靶点、多个信号通路来影响OPF 的发生，其中主要的基因靶点有CASP3、 ADRB2、 BAX、 BCL2、CASP8、ESR2、CASP9、DPP4、GSK3B、F2、MAPK14等，这些基因靶点可以通过影响细胞对有机环状化合物的反应、对荷尔蒙的反应、细胞对有机氮化合物的反应等BP 来控制OPF 的发生。CASP3 是主要的凋亡分子，研究发现靶向CASP3 能够通过肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径抑制凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、细胞色素C（Cytc）和BAX蛋白的促凋亡作用，从而恢复成骨细胞的活跃度和成骨分化[13]。研究发现ESR2 基因的遗传变异与健康人的骨密度变化紧密联系，ESR2 基因能够通过对骨肉瘤、子宫内膜癌、子宫肌瘤等癌症相关染色体基因的调控从而影响OPF 的发生[14]。本研究中续断治疗OPF 涉及通路包括恶性肿瘤、弓形体病、卡波西肉瘤有关的疱疹病毒感染、乙肝、大肠癌以及小细胞肺癌所涉及的脂质和动脉粥样硬化等信号传播通路等。前人实验发现肺癌能够通过体内环境激活破骨细胞并引导dickkopf 相关蛋白1（DKK1）和TNF-α抑制成骨细胞分化，使骨质发生溶骨性病变而发生OPF[15-17]。调控TNF-α 能够通过MAPK 通路调节破骨细胞和成骨细胞的增殖分化，对骨重建过程进行调控，促进骨愈合，达到抗骨质疏松的作用[18]。临床发现乙肝患者能通过感染相关炎症反应，使患者钙代谢紊乱，导致OPF 发生[17]。在骨质疏松与动脉粥样硬化的相关危险因素的研究中指出，年龄增长、高血糖、高血脂等危险因素可促进人体骨质疏松和动脉粥样硬化发生，通过动脉粥样硬化通路能够调控骨质疏松发生过程中的转录因子和细胞外基质等[19]。

分子对接的结果显示，（E，E）-3，5-二邻咖啡酰奎宁酸、龙胆碱、威岩仙皂苷A_qt 与ADRB2、威岩仙皂苷A_qt 与CASP8、β-谷甾醇与CASP3 的结合能均小于-8 KJ/mol，表明这些化合物的结合活力较高并具备较强的稳定性，验证了续断的有效成分对于OPF 核心靶点之间存在有效亲和力。CASP 是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，常见成员有CASP3、CASP6、CASP8和CASP9 等，参与了细胞凋亡、分化和炎症反应过程，与癌症等多种疾病的发病机制关系密切[20]。KEGG 通路富集发现差异蛋白主要富集在与癌症的相关通路，与分子对接结果相吻合。研究发现ADRB2能够通过激活腺苷酸环化酶与G 蛋白偶联受体结合形成活性态三元复合物，促进跨膜信号传导[21]。这与GO 通路富集结果相呼应，GO 富集通路显示主要有膜筏、膜微域和突触前膜3 个部分的总体成分参与主要的分子功能，促进分子跨膜运输传导。

综上所述，续断龙胆碱、林生续断苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二邻咖啡酰奎宁酸、β-谷甾醇、谷甾醇等成分能够作用于CASP3、 ADRB2、 BAX、 BCL2、CASP8、ESR2 等靶点来调控癌症、弓形体病、雌激素信号等信号通路减缓OPF 进程。