基于网络药理学分析补气养血通络组方对硼替佐米诱导的周围神经病变机制

杨 东， 王 苗， 张 楠

（1.河北省优抚医院内一科，石家庄 050000； 2.河北省沧州中西医结合医院放化疗科，沧州 060000； 3.河北省沧州中西医结合医院脊柱脊髓四科，沧州 060000）

多发性骨髓瘤是一种发生于血液系统的恶性肿瘤，其临床特点为浆细胞的单克隆扩增过程异常，虽然对其疾病机制的认识和理解不断增加，但治疗结果欠佳，即使对化疗有初步反应的患者也可能逐渐出现耐药性[1]。美国食品药品监督管理局2003 年批准硼替佐米可应用于多发性骨髓瘤的治疗，它是首次被应用于治疗该病的蛋白酶体抑制剂[2-3]，但存在诸多不良反应，其诱导的周围神经病变较常出现[4]。硼替佐米诱导的周围神经病变（bortezomib-induced peripheral neuropathy，BIPN）的特征是感觉功能障碍，其症状包括神经性疼痛、四肢麻木、感觉异常丧失、灼热感等，还可能影响运动神经功能，严重甚至会瘫痪[5-7]。

网络药理学作为一种新兴的生物学研究方法，能够将中药复方制剂的药物活性成分与潜在治疗靶点进行匹配，进而构建互作网络，有助于了解中草药发挥生物学作用的药理学机制，筛选出治疗疾病的有效成分，提高药物治疗效果。因此，本研究通过采用网络药理学的研究策略明确补气养血通络组方治疗BIPN 的机制。

1 资料与方法

1.1 补气养血通络组方相关治疗靶点的筛选

利用中药系统药理数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）在线数据库（https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[8]初步筛选补气养血通络组方的中药化学组成成分，筛选条件存在两个维度，分别是口服利用度与类药性，被纳入进一步研究的组成成分需要同时满足口服利用度≥30%与类药性≥0.18 两个条件，并进一步通过该数据库获得相关组成成分的作用靶点。然后，依据自Uniport 数据库（https：//www.uniport.org）获取的蛋白质注释信息对上一步获取的作用靶点信息进行注释。

1.2 BIPN 相关靶点筛选

以“bortezomib-induced peripheral neuropathy”为关键词进行BIPN 相关靶点筛选，在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org）以及OMIM 数据库（http：//www.omim.org）进行检索，得到BIPN相关靶点，然后利用R 4.1.2 软件将两者取并集，再去重获得BIPN 的相关靶点。

1.3 补气养血通络组方与BIPN 相关靶点筛选及中药—活性成分—靶点—疾病网络图构建

为进一步明确补气养血通络组方与BIPN 的关系，基于R 4.1.2 软件将补气养血通络组方的靶点与BIPN 相关靶点取交集获得共同靶点，然后利用R 4.1.2 软件绘制韦恩图将其可视化。进一步筛选出可作用于共同靶点的补气养血通络组方中主要的相关活性成分，并以Cytoscape 3.8.0 软件为基础，结合上述得到的各作用靶点、BIPN 以及补气养血通络组方中的有效活性成分之间的关系，从而构建中药—活性成分—靶点—疾病网络关系图。

1.4 补气养血通络组方治疗BIPN 的蛋白互作网络构建以及核心靶点筛选

将补气养血通络组方与BIPN 相关的共同靶点导入蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI）平台STRINGv11.0（https：//www.string-db.org），设置纳入筛选物种为“Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值为最高等可置信区间（＞0.9），隐藏没有相互作用的靶点基因，其余相关参数的设置均不作任何修改，最终得到蛋白相互作用网络的可视化网络图及相关数据结果。利用Cytoscape 3.8.0 读取上述数据结果的tsv 文件作进一步分析。利用Cytoscape 3.8.0 中的cytoHubba 扩展插件，根据度值筛选出位列前10的靶点。

1.5 补气养血通络组方治疗BIPN 靶点GO 功能富集分析

GO 功能富集分析使用了R 4.1.2 软件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包进行GO功能富集分析。根据筛选条件基因富集数目与显著程度（P＜0.05，Q＜0.05），利用R 4.1.2 ggplot2 包分别将生物过程（biological process，BP）、细胞组成和分子功能（molecular function，MF）中排名前10 的条目绘制成柱状图。

1.6 补气养血通络组方治疗BIPN 靶点KEGG通路富集分析

利用R 4.1.2 软件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包进行KEGG 通路富集分析，根据筛选条件基因富集数目与显著程度（P＜0.05，Q＜0.05），筛选出主要的70 条KEGG 通路。利用R 4.1.2 的ggplot2 包将上述结果可视化。进一步利用R 4.1.2 的pathview 包将治疗相关靶点映射至主要的信号通路并将其可视化。

1.7 分子对接

在度值位列前10 的活性成分及靶点中，挑选出适当的活性成分及靶点。通过检索PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取补气养血通络组方中活性成分的2D 分子组成结构。通过检索美国生物物理结构数据库中心（https：//www.rcsb.org/） 获得靶点的3D 大分子结构。使用ChemBio3D Ultra 14.0 软件将活性成分的2D 结构输出为mol2 格式。使用PyMOL 2.4.0 软件将靶点的3D 大分子结构进行预处理，去除水分子及小分子配体，并将结果输出为pdb 格式。使用AutoDockTools 1.5.6 软件将靶点的3D 大分子结构渲染为2D 图像，并将结果输出为pdbqt 格式文件；再次使用该软件确定靶点的分子活性口袋，并输出相应参数；同时，使用该软件将有效成分的2D 分子组成结构渲染为2D 图像，并输出为pdbqt 格式文件。利用上述过程得到的两个pdbqt 文件及分子活性口袋的相应参数，在vina软件中进行分子对接，最终利用PyMOL 2.4.0 软件输出最终的结果。依据vina 软件输出的affinity值评价有效成分与靶点的亲和力。

2 结果

2.1 补气养血通络组方中活性成分及其靶点筛选

依托TCMSP 平台，查找补气养血通络组方中的潜在治疗成分，并以口服利用度≥30%及类药性≥0.18 为条件进一步筛选相关成分，最后共得到白芍的活性成分13 种，丹参的活性成分59种，大枣的活性成分29 种，桂枝的活性成分7种，黄芪的活性成分20 种，鸡血藤的活性成分24 种，路路通的活性成分4 种，生姜的活性成分5 种。经过合并去重获得补气养血通络组方的活性成分为139 种。

2.2 药物—疾病有效成分靶点筛选

将通过TCMSP 数据库获取的补气养血通络组方相对应的靶点蛋白，进一步依据Uniport 数据库中的相关蛋白质信息进行注释完成标准化，取交集后共得到作用靶点255 个。其中，白芍作用靶点为76 个，丹参作用靶点为116 个，大枣作用靶点为184 个，桂枝作用靶点为40 个，黄芪作用靶点为185 个，鸡血藤作用靶点为120 个，路路通作用靶点为97 个，生姜作用靶点为44 个。通过GeneCards 数据库检索关键词bortezomibinduced peripheral neuropathy，共得到652 个BIPN 相关靶点；通过OMIM 数据库检索共得到174 个BIPN 相关靶点。利用R 4.1.2 的venn 包，合并且去重后获得815 个BIPN 相关靶点。进一步将补气养血通络组方的255 个中药成分靶点与BIPN 相关靶点取交集获得97 个共同靶点，并通过R 4.1.2 的venn 包绘制Venn 图（图1）进行可视化。

图1 补气养血通络组方与硼替佐米诱导的周围神经病变共同靶点的韦恩图

2.3 中药—活性成分—靶点—疾病网络关系的构建

将补气养血通络组方与BIPN 共同的靶点作为研究对象，再将组方中的有效成分与单种药材的相应关系以及有效成分与共同靶点的关系导入Cytoscape 3.8.0 软件进行优化分析，最终获得一个有201 个节点以及638 条边的中药—活性成分—靶点—疾病的网络关系图（图2）。通过Cytoscape 3.8.0 自带的Network Analyze 分析网络关系图中的网络拓扑学参数，度值越大表明该有效成分越关键。在这个网络中筛选出前10 位的活性成分为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、熊果酸（ursolic acid）、山柰酚（kaempferol）、丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA）、甘草查尔酮A（licochalcone A）、β-胡萝卜素（beta-carotene）、芒柄花黄素（formononetin）、芦荟大黄素（aloe-emodin）、异鼠李素（isorhamnetin）。进一步推测这10 种成分在补气养血通络组方治疗BIPN 中作为核心成分起到了关键作用，同时也印证了补气养血通络组方可能同时作用于多个靶点治疗BIPN。

图2 补气养血通络组方有效成分与硼替佐米诱导的周围神经病变的相互作用关系

2.4 PPI 蛋白相互作用网络的构建

在STRING 数据库中输入补气养血通络组方和BIPN 共同的靶点97 个，设置筛选种族为“Homo sapiens”，设定了最低相互作用阈值高等可置信区间（＞0.9），并去除孤立的没有相互作用的靶点，其余参数不做修改，最终得到PPI 蛋白相互作用网络图（图3），并采用Cytoscape 3.8.0软件读取上述相关数据结果的tsv 文件。通过Cytoscape 3.8.0 中的CytoHubba 扩展插件挑取排列在前10 的关键靶点，为TP53、AKT1、MAPK14、FOS、RELA、MYC、STAT3、CTNNB1、ESR1、MAPK1，提示这些成分可能是补气养血通络组方治疗BIPN 的核心靶点基因，这为进一步探究补气养血通络组方治疗BIPN 的深层次机制提供了重要方向。

图3 补气养血通络组方治疗硼替佐米诱导的周围神经病变的PPI 网络图

2.5 补气养血通络组方治疗BIPN 的靶点GO 功能富集分析

利用R 4.1.2 软件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 软件包进行GO 功能富集分析，最终共获得涉及BP 2 105 个，主要包括细胞环境刺激的反应、细胞化学应激的反应、细胞对非生物刺激的反应、氧化应激反应、对金属离子的响应；涉及细胞组成69 个，主要包括细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶、膜微域、膜筏、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白激酶复合物等；涉及MF 146 个，主要包括DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合、转录因子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、泛素样蛋白连接酶结合。利用R 4.1.2 的ggplot2 包将排名前10 的BP、细胞组成和MF 绘制成柱状图（图4）。

图4 GO 功能富集分析结果（前10 位）

2.6 补气养血通络组方治疗BIPN 的靶点KEGG通路富集分析

利用R 4.1.2 软件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包进行KEGG 通路富集分析，根据基因富集数目与显著程度（P＜0.05，Q＜0.05），筛选出主要的70 条KEGG 通路（图5），主要涉及细胞凋亡、蛋白质聚糖在癌症中的应用，NFκB 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、FoxO 信号通路、p53 信号通路、MAPK 信号通路、JAK-STAT 信号通路等与治疗BIPN 相关的信号通路。利用ggplot2 包将上述结果可视化，pathview 包将治疗相关靶点映射至PI3K-Akt 信号通路并将其可视化（图6）。

图5 KEGG 通路富集分析结果（前70 位）

图6 PI3K-Akt 信号通路

2.7 分子对接

最终选取了槲皮素与TP53（PDB ID：8F2I）和AKT1（PDB ID：6HHF）进行分子对接。affinity值的单位为kcal·mol-1，可以用来比较配体与靶分子相互作用的能力。一般来说，可以将配体的affinity 值分为3 个级别：高affinity：两者之间的相互作用能力非常强，一般在-7.0 kcal·mol-1以下；中affinity：两者之间的相互作用能力中等，一般在-7.0～-5.0 kcal·mol-1；低affinity：两者之间的相互作用能力较弱，一般在-5.0 kcal·mol-1以上。槲皮素与TP53 与AKT1 的affinity 值分别为-7.9 kcal·mol-1和-9.3 kcal·mol-1。提示槲皮素与两个靶点有良好的亲和力，两者结合的结构比较稳定，其分子对接的3D 模拟结合图见图7、图8。

图7 槲皮素与TP53 的分子对接模式图

图8 槲皮素与AKT1 的分子对接模式图

3 讨论

硼替佐米联合治疗方案最主要的剂量限制性不良反应是硼替佐米药物诱导出现的周围神经病变，并且BIPN 的发病率存在增长趋势[9-11]。但即使终止硼替佐米治疗后，神经功能的损害也不是完全可逆的[12-14]。因此，寻求新的治疗方法和策略、预防和治疗BIPN 相关症状十分有必要。

中医多认为多发性骨髓瘤从属于骨痹，自拟方剂补气养血通络组方用于治疗BIPN，以《金匮要略》中黄芪桂枝五物汤为基础，加以路路通、丹参、鸡血藤配制而成，具有滋补气血、温养经络、缓解痹症、减少疼痛的作用。本研究通过“药物—活性成分—靶点—疾病”相互作用网络初步筛选出补气养血通络组方治疗BIPN 的主要活性成分为槲皮素、木犀草素、熊果酸、山柰酚、丹参酮ⅡA、甘草查尔酮A、β-胡萝卜素、芒柄花黄素、芦荟大黄素、异鼠李素。KEGG 通路的富集分析主要是细胞凋亡、蛋白质聚糖在癌症中的应用，FoxO 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、AK-STAT 信号通路、IL-17 信号通路、p53信号通路、NF-κB 信号通路、JAK-STAT 信息通路等与BIPN 治疗相关的信号通路。

MAPK 信号通路在BIPN 的发展过程中发挥着重要作用。背根神经节神经元中c-Jun N 末端激酶（JNK）和p38 MAPK 的磷酸化增加，这些激酶的药理学抑制作用对于BIPN 相关病变有促进作用[15]。Liu 等[16]通过动物实验证明，STAT3 的药理或遗传性抑制以及NLRP3 siRNA 的治疗可以预防硼替佐米诱导的大鼠和小鼠机械性疼痛的产生。Alé 等[17]研究表明，经过硼替佐米治疗，与野生型小鼠相比，NF-κB 活化受损的小鼠出现严重程度较低的神经病变。抑制NF-κB 信号通路可能是治疗多发性骨髓瘤和BIPN 联合的一种有前景的治疗策略。槲皮素具有抗炎症、抗癌症、降低氧化应激、免疫调节等重要功效[18-19]。近年来，槲皮素对神经元的保护作用越来越受到临床医生的关注。Godoy 等[20]报道，槲皮素对海马神经元中由H2O2诱导的神经细胞损伤有保护作用，可缓解由H2O2介导的活性氧分子的增多、线粒体损伤以及神经元损伤，并可降低H2O2对神经元线粒体动力学以及能量代谢的影响。Lee 等[21]发现，槲皮素通过激活ERK1/2 信号通路，从而使小鼠胚胎来源的原代皮层神经元细胞免于受DL-丁硫氨酸亚砜的损伤。Lei 等[22]通过动物实验证明，槲皮素通过Akt 信号的上调在脑组织中起到了神经保护作用。吕明义等[23]通过动物实验研究表明，木犀草素通过抑制JAK2/STAT3 信号通路激活，降低组织间的炎性反应以及减少细胞凋亡，并进一步保护神经系统的功能。熊果酸可以通过Nrf 2 信号通路，减少ROS 的产生，增强抵抗氧化应激防御系统从而起到抗氧化的作用，还可以通过调控NF-κB 和MAPK 信号通路，抵抗炎症反应，起到良好的神经保护作用[24]。

综上所述，补气养血通络组方含有多种活性成分，通过多途径、多靶点发挥治疗BIPN 的作用。本研究通过网络药理学研究探究了补气养血通络组方中的有效活性成分、潜在靶点以及信号通路。从整体分析了补气养血通络组方在多成分、多途径、多靶点上治疗BIPN 的潜在机制，为BIPN 患者提供了一个潜在的治疗策略。然而，本研究未考虑中药方剂在煎煮过程中的化学变化以及体内的代谢过程，因此需要进行更深入的临床研究，以进一步证实补气养血通络组方在治疗BIPN 中的作用。