柳叶蜡梅醇提物酚类成分及其抗氧化活性研究

何纪元，邓柳鸿，李欣悦，高逸萱，刘盛荣，魏奇

1.宁德师范学院生命科学学院 （宁德 352100）；2.福建省科技厅产学研合作示范基地 （宁德 352100）；3.闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心 （宁德352100）

抗氧化剂主要分为天然和化学合成2种类型。化学合成的抗氧化剂具有毒性、致癌性、致畸性等特点，使用过量的化学抗氧化剂会危害机体的健康[1-3]。因此，获得高效无毒的天然抗氧化剂具有十分重要的意义。多酚是一种天然的抗氧化剂，能够有效清除自由基[4-5]。植物多酚已被广泛应用于水产品、果蔬及畜禽肉等制品的储运和保鲜。植物多酚可作为食品添加剂延长食品的保质期[6]。研究植物多酚的成分和抗氧化活性，有助于新型食品添加剂的研发。

柳叶蜡梅（Chimonanthussalicifolius），又名毛山茶、山蜡梅，是一种药食两用的植物。柳叶蜡梅的用途广泛，常用于制备食凉茶，别名黄金茶。柳叶蜡梅的应用有着悠久的历史，并且在畲族药物中运用极广，被誉为“畲药第一味”[7-8]。畲族百姓早在北宋时就已开始利用柳叶蜡梅来预防和医治感冒。有研究表明柳叶蜡梅具有清热解毒、理气健脾、预防感冒、消暑解暑和消导止泻等功效[9]。邹永等[10]研究发现柳叶蜡梅提取物能够减少急性胃黏膜损伤大鼠胃部的溃疡面积，对保护胃黏膜具有积极的作用。温慧萍等[11]研究发现柳叶蜡梅水提物具有止泻的作用。张健健等[12]研究发现柳叶蜡梅提取物具有保肝的作用。市场上柳叶蜡梅相关食品相对较少。研究柳叶蜡梅酚类成分和体外抗氧化活性能为柳叶蜡梅在保健食品开发和应用提供理论基础，具有良好的开发前景。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 材料与试剂

2,2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐（ABTS）、福林酚、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、维生素E（北京索莱宝科技有限公司）；乙醇、氯化铁、铁氰化钾、碳酸钠、过硫酸钾、氢氧化钠、过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 主要仪器与设备

TGL-21高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；FDU-2110冷冻干燥机、N-1300旋转蒸发仪（日本东京理化有限公司）；Xevo TQ-S三重四极杆质谱（美国沃特世公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Waters Acqutiy UPLC H-Class超高效液相色谱（美国沃特世公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 柳叶蜡梅醇提物的制备

将柳叶蜡梅叶片进行烘干处理，采用多功能粉碎机进行粉碎处理。取100 g柳叶蜡梅粉末，以1∶10 g/mL料液比加入70%的乙醇，水浴锅中提取3 h（80 ℃），过滤去除残渣。滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥后得到柳叶蜡梅醇提物。

1.2.2 总酚的测定

参照陈龙等[13]的方法测定总酚含量。分别将样品溶液（200 μL）、蒸馏水（800 μL）和福林酚（200 μL）加入至10 mL离心管中，混匀后，避光静置6 min。加入2 mL 7%的Na2CO3溶液和1.6 mL蒸馏水，混匀后，避光反应90 min。在波长760 nm处测定样品的吸光度。通过没食子酸标准曲线的回归方程Y=0.001 8X+0.040 7（R2=0.992），计算总酚的含量。

1.2.3 酚类成分的测定

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；柱温40 ℃；进样体积4 μL；流速0.2 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水溶液+5 mmol/L的乙酸铵溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～5 min，90%～10% A；5～6 min，10% A；6～8 min，10%～50% A；8～9 min，50%～90% A；9～10 min，90% A。

1.2.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离（ESI）源；扫描方式为多级反应监测；毛细管电压3.0 kV（正模式）、1.5 kV（负模式）；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度500 ℃（正模式）、450 ℃（负模式）。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基的清除率参照杨娟等[14]的方法进行测定。准确称取8 mg DPPH于50 mL离心管中，加入40 mL无水乙醇溶液，采用超声处理5 min，使其充分混匀。将DPPH溶液在波长517 nm处的吸光度调至1.2～1.3。在96微孔板中加入100 μL的样品溶液和100 μL的DPPH溶液，充分混匀后，避光静置30 min，使用酶标仪测定波长519 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下获得A2和A0。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

式中：A1为样品与DPPH反应的吸光度；A2为无水乙醇代替DPPH的吸光度；A0为无水乙醇代替样品的吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除率的测定

ABTS自由基的清除率参照陈晓宁等[15]的方法进行测定。将10 mL过硫酸钾溶液（2.6 mmol/L）和10 mL的ABTS溶液（7.4 mmol/L）充分混匀后，避光静置12 h。将ABTS工作液在波长734 nm处的吸光度调至0.7。将ABTS工作液（100 μL）和样品溶液（100 μL）充分混匀后，避光反应6 min（25 ℃），使用酶标仪测定波长734 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。ABTS自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为样品与ABTS反应的吸光度；A2为蒸馏水代替ABTS的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.6 羟自由基清除率的测定

羟自由基清除率的测定参照侯文井等[16]的方法进行测定。分别取1 mL的水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL的样品溶液，1 mL的FeSO4溶液（9 mmol/L）和1 mL的H2O2溶液（9 mmol/L）置于15 mL玻璃试管中，混匀后，置于暗室，在37 ℃条件下反应30 min。使用酶标仪测定波长510 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。羟自由基清除率按式（3）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.7 超氧阴离子自由基清除率的测定

超氧阴离子自由基清除率的测定参照周萍等[17]的方法进行测定。于15 mL玻璃试管中分别加入2 mL样品溶液和2 mL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH 8），混匀后，于25 ℃静置10 min。加入0.4 mL邻苯三酚溶液（10 mmol/L），混匀后，25 ℃静置5 min。加入0.2 mL盐酸溶液（12 mol/L）终止反应。使用酶标仪测定波长325 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。超氧阴离子自由基清除率按式（4）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.8 还原力的测定

参照魏奇等[18]的方法测定柳叶蜡梅醇提物的还原能力。于15 mL玻璃试管中分别加入2.5 mL样品溶液、2.5 mL磷酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）、2.5 mL铁氰化钾溶液（10 mg/mL）混合均匀，在50 ℃条件下静置20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸（100 mg/mL），混合均匀，离心（3 500 r/min，10 min）。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和1 mL氯化铁溶液（1.0 mg/mL），混合均匀。使用酶标仪测定波长700 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。还原力按式（5）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为样品组本底的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.9 数据统计与分析

试验重复次数为3次，应用SPSS 26软件进行数据分析，通过Graph Prism 9.0软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 柳叶蜡梅醇提物酚类成分分析结果

柳叶蜡梅醇提物的总酚含量为169.18±2.49 mg/g。由表1可知，柳叶蜡梅醇提物的酚类成分主要为杨梅黄素、芦丁、儿茶素、表儿茶素和绿原酸。柳叶蜡梅醇提物中杨梅黄素最高（42.46±4.37 mg/kg）。其中：槲皮素、芦丁和杨梅黄素属于黄酮醇类；儿茶素和表儿茶素属于黄烷类；对香豆酸、原儿茶酸和丁香酸属于酚酸类；绿原酸、阿魏酸和咖啡酸属于苯丙素类。

表1 柳叶蜡梅醇提物酚类成分含量

2.2 柳叶蜡梅醇提物对ABTS自由基的清除作用

由图1可知，在质量浓度为15.63 μg/mL时，水溶性维生素E能够完全清除ABTS自由基。在15.63～31.25 μg/mL的质量浓度范围内，ABTS自由基清除作用随着柳叶蜡梅醇提物的质量浓度的增加而逐渐增强。质量浓度31.25～62.50 μg/mL时，柳叶蜡梅醇提物对ABTS自由基的清除率为99.96%±0.20%。柳叶蜡梅醇提物对ABTS自由基的半数清除浓度（IC50）为8.98 μg/mL。

图1 柳叶蜡梅醇提物对ABTS自由基的清除能力

2.3 柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基的清除作用

如图2所示，在31.25～500 μg/mL的质量浓度范围内，柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基的清除作用随着浓度的增加而增强。质量浓度500 μg/mL时，柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基的清除率为87.21%±0.71%。在相同质量浓度的条件下，柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基的清除作用小于水溶性维生素E。柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基清除作用的IC50为46.10 μg/mL。

图2 柳叶蜡梅醇提物对DPPH自由基的清除能力

2.4 柳叶蜡梅醇提物对羟自由基的清除作用

由图3可知，水溶性维生素E质量浓度为5，10和20 mg/mL时，水溶性维生素E对羟自由基的清除作用没有显著性差异（P＞0.05）。柳叶蜡梅醇提物对羟自由基的清除率呈现逐渐增强的作用。柳叶蜡梅醇提物质量浓度20 mg/mL时，其对羟自由基的清除率为53.13%±2.52%。柳叶蜡梅醇提物对羟自由基清除作用的IC50值为16.21 mg/mL。

图3 柳叶蜡梅醇提物对羟自由基的清除能力

2.5 柳叶蜡梅醇提物对超氧阴离子自由基的清除作用

如图4所示，水溶性维生素E质量浓度0.50～8 mg/mL时，水溶性维生素E对超氧阴离子自由基的清除作用随着其质量浓度增大而增强。质量浓度大于4 mg/mL时，柳叶蜡梅醇提物对超氧阴离子的清除作用强于水溶性维生素E。柳叶蜡梅醇提物的质量浓度8 mg/mL时，其超氧阴离子清除率达90.29%±1.34%。柳叶蜡梅醇提物的超氧阴离子清除率IC50值为2.85 mg/mL。

图4 柳叶蜡梅醇提物对超氧阴离子自由基的清除能力

2.6 柳叶蜡梅醇提物还原能力的测定

如图5所示，在0.31～5 mg/mL质量浓度范围下，水溶性维生素E和柳叶蜡梅醇提物的还原能力均随着其质量浓度的增加而增强。柳叶蜡梅醇提物质量浓度5.00 mg/mL时，其还原力大小为1.54±0.03，表现出一定的还原能力。

图5 柳叶蜡梅醇提物还原能力

3 讨论与结论

柳叶蜡梅是畲族药食同源的植物，具有极高的食药用价值，在食品、医药和美容等方面有着很好的应用前景。郭孝成等[19]研究发现柳叶蜡梅水提物和醇提物具有抗氧化活性。陈建烟[20]研究发现浙江蜡梅甲醇提取物具有强的清除DPPH自由基作用和还原力。赵梓桐等[21]研究发现柳叶蜡梅醇提物具有清除ABTS自由基和DPPH自由基的作用，与试验结果一致。试验表明柳叶蜡梅醇提物对ABTS自由基、DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基IC50的值分别为8.98 μg/mL，46.10 μg/mL，16.21 mg/mL和2.85 mg/mL。柳叶蜡梅醇提物具有体外清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的作用，清除作用的效果大小依次为ABTS＞DPPH＞超氧阴离子＞羟自由基。

有研究表明柳叶蜡梅中富含芦丁、槲皮素、山奈酚、表儿茶素、原花青素C及糖苷类物质[22-24]。潘心禾等[25]研究发现柳叶蜡梅乙醇提取物中含有槲皮素、7-羟基-6-甲氧基香豆素和山萘酚。孙启[26]研究发现亮叶蜡梅叶乙醇提取物中含有较多的槲皮素、山奈酚和山奈酚衍生物。试验测得柳叶蜡梅醇提物的总酚含量为169.18±2.49 mg/g。柳叶蜡梅提取物中主要酚类成分为杨梅黄素、芦丁、儿茶素、表儿茶素和绿原酸。通过对柳叶蜡梅醇提物的抗氧化活性及酚类成分分析，为柳叶蜡梅活性成分的提取及天然食品保鲜剂的开发提供理论基础。