硫磺菌醇提物抗氧化活性及其成分分析

杨晶晶，池延添，易永旺，林国峰，曾亮，魏奇

1.宁德师范学院生命科学学院 （宁德 352100）；2.福建省科技厅产学研合作示范基地 （宁德 352100）；3.闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心 （宁德352100）

硫磺菌（Laetiporussulphureus）是一种食药两用的大型真菌[1]。硫磺菌主要生长在针叶树和橡树等阔叶树的茎上[2]。硫磺菌富含多糖、氨基酸、甾醇类化合物等活性物质，并具有多种药用功效。已有研究表明硫磺菌能够抑制肺癌细胞的生长，并且能够有效抑制病原菌的生长，如小麦赤霉、金黄色葡萄球菌、黑根霉等[3]。硫磺菌所产生的甲酸酯物质对机体代谢调节具有十分重要的作用[4]。

自由基会对机体的细胞和组织造成损伤，进而引起机体的衰老和一系列慢性疾病的发生。已有研究表明阿尔兹海默症、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和衰老等疾病与自由基有关[5]。人工合成的抗氧化剂具有毒副作用，对人体具有不利影响[6]。因此，从植物中开发天然抗氧化剂，能够有效延长食品的贮藏期。

此研究以硫磺菌为原料，探究硫磺菌醇提物的体外抗氧化活性，同时测定了硫磺菌醇提物的多糖、总酚、黄酮和三萜含量。此研究能够促进天然食品抗氧化剂的进一步开发。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 原料与试剂

试验原料：硫磺菌（宁德师范学院生命科学学院生物活性物质研究实验室）。

水溶性维生素E、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、芦丁、齐墩果酸、2,2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐（ABTS）、没食子酸（北京索莱宝科技有限公司）；水杨酸、葡萄糖、无水乙醇、硫酸、亚硝酸钠、氯乙酸、硫酸亚铁、磷酸钠缓冲液和铁氰化钾等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 仪器与设备

DHG-9070A鼓风干燥箱、HWS-24恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；N-1300旋转蒸发仪（日本Tokyo Rikakikai公司）；SHZ-DⅢ 循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；BO-250T高速多功能粉碎机（永康铂欧五金厂）；SPectra Max i3X多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

将硫磺菌子实体置于65 ℃烘箱中烘干、粉碎、过筛。称取100 g硫磺菌粉末，按料液比1∶10 g/mL加入无水乙醇，在85 ℃水浴锅中提取3 h，去除残渣，收集滤液。滤液用旋转蒸仪去除乙醇，经真空干燥后得硫磺菌醇提物。

1.2.2 硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除作用

参照陈晓宁等[7]的方法测定硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的能力，以水溶性维生素E为阳性对照。DPPH（8 mg）溶解于无水乙醇中（40 mL），置于超声清洗器中处理5 min。测定DPPH溶液在波长519 nm处的吸光度，用无水乙醇调至1.2。硫磺菌醇提物的质量浓度为125，250，500，1 000和2 000 mg/mL。将相同体积的DPPH溶液和样品溶液（100 μL）混匀后，置于暗室反应30 min，测定波长519 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下获得A2和A0。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

式中：A1为样品与DPPH反应的吸光度；A2为无水乙醇代替DPPH的吸光度；A0为无水乙醇代替样品的吸光度。

1.2.3 硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除作用

参照齐睿婷[8]的方法测定硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的能力，以水溶性维生素E为阳性对照。将相同体积的过硫酸钾溶液（2.6 mmol/L，10 mL）和ABTS溶液（7.4 mmol/L，10 mL）混匀后，置于暗室反应12 h。硫磺菌醇提物的质量浓度为62.5，125，250，500和1 000 μg/mL。ABTS溶液在波长734 nm处的吸光度调至0.7。将相同体积的ABTS溶液和样品溶液（100 μL）混匀后，置于暗室反应6 min，测定波长734 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。ABTS自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为样品与ABTS反应的吸光度；A2为蒸馏水代替ABTS的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.4 硫磺菌醇提物对羟自由基的清除作用

参照颜军等[9]的方法测定硫磺菌醇提物清除羟自由基的能力，以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.5，1，2，4和8 mg/mL。将相同体积的水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L，1 mL）、样品溶液，FeSO4溶液（9 mmol/L，1 mL）和H2O2溶液（9 mmol/L，1 mL）混匀后，置于37 ℃恒温培养箱中反应30 min。测定波长510 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。羟自由基清除率按式（3）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.5 硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基清除作用

参照谭亮等[10]的方法测定硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除能力，以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mg/mL。将5 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 8.2）和5 mL样品溶液混匀后，于25 ℃水浴中静置20 min。加入0.4 mL邻苯三酚溶液（10 mmol/L）混匀后，于25 ℃静置5 min。再加入0.2 mL盐酸溶液（12 mol/L）终止反应。测定波长325 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。超氧阴离子自由基清除率按式（4）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.6 硫磺菌醇提物还原能力的测定

参照张晨[11]的方法测定硫磺菌醇提物还原能力，以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.31，0.63，1.25，2.50和5.00 mg/mL。于15 mL玻璃试管中分别加入2.5 mL样品溶液、2.5 mL磷酸钠缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）、2.5 mL铁氰化钾溶液（10 mg/mL）混合均匀，在50 ℃条件下静置20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸（100 mg/mL），混合均匀，离心（3 500 r/min，10 min）。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸馏水和1 mL氯化铁溶液（1.0 mg/mL），混合均匀。测定波长700 nm处的吸光度，记为A1，相同操作条件下，获得A2和A0。还原力按式（5）计算。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为样品组本底的吸光度；A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.7 硫磺菌醇提物中多糖含量的测定

参照梁琰等[12]的方法测定多糖含量。葡萄糖标准溶液的质量浓度分别为0，100，200，300，400，500，600，700，800和900 μg/mL。在15 mL离心管中分别加入1 mL样品溶液，1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，混匀，静置15 min，测定波长490 nm下的吸光度。葡萄糖的标准曲线为Y=0.004X+0.146 8（R2=0.999）。

1.2.8 硫磺菌醇提物中总酚含量的测定

参照陈龙等[13]的方法测定总酚含量。没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0，20，100，150，200，300，400，500和600 μg/mL。在15 mL离心管中分别加入200 μL样品溶液，800 μL蒸馏水和200 μL福林-酚，混合，避光静置6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL蒸馏水，混匀后置于暗室反应90 min，测定760 nm波长处的吸光度。没食子酸标准曲线为Y=0.001 8X+0.040 7（R2=0.992）。

1.2.9 硫磺菌醇提物中总黄酮含量的测定

参照杨文慧等[14]的方法测定总黄酮含量。芦丁标准溶液的质量浓度分别为0，20，100，150，200，300，400，500和600 μg/mL。在15 mL离心管中加入5 mL样品溶液和300 μL 的NaNO2溶液（5%），混匀后，避光静置6 min。加入300 μL的Al(NO3)3溶液（10%），混匀后，避光静置6 min。加入4.4 mL NaOH溶液（4%），混匀后，避光静置12 min，测定510 nm波长处的吸光度。芦丁的标准曲线为Y=0.003 5X-0.015 5（R2=0.997）。

1.2.10 硫磺菌醇提物中总三萜含量的测定

参照亓小妮[15]的方法测定总三萜的含量。齐墩果酸标准溶液的质量浓度分别为0，20，40，60，80和100 μg/mL。取0.5 mL样品溶液，在90 ℃条件下挥干，冷却后加入0.25 mL香草醛-醋酸溶液（5%），0.4 mL蒸馏水和1.5 mL高氯酸，于60 ℃水浴15 min，再加入2.5 mL冰醋酸，在540 nm波长处测定样品的吸光度。齐墩果酸的标准曲线为Y=0.007 2X-0.040 3（R2=0.997）。

1.3 数据分析

采用Excel统计软件进行数据分析，试验的重复次数为3次。应用SPSS 20软件进行显著性分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的测定

如图1所示，当水溶性维生素E的质量浓度为125 μg/mL时，水溶性维生素E已经能够将DPPH自由基全部清除。硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除作用随其质量浓度的增加随之增强。当硫磺菌醇提物的质量浓度为2 000 μg/mL时，此时硫磺菌醇提物能够将DPPH自由基全部清除，其清除率为96.26%±0.42%。硫磺菌醇提物的DPPH自由基清除率EC50值为820.20 μg/mL。

图1 硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除能力

2.2 硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的测定

由图2可知，当质量浓度为62.50 μg/mL时，水溶性维生素E已经能够将ABTS自由基全部清除。硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除作用呈现上升趋势。当硫磺菌醇提物的质量浓度为1 000 μg/mL时，硫磺菌醇提物已经能够将ABTS自由基基本清除，其清除率为94.27%±2.27%。硫磺菌醇提物的ABTS自由基清除率EC50值为317.09 μg/mL。

图2 硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除能力

2.3 硫磺菌醇提物清除羟自由基的测定

由图3可知，随着水溶性维生素E和硫磺菌醇提物质量浓度的增加，其对羟自由基的清除率呈现出逐渐增强的趋势。当硫磺菌醇提物的质量浓度为8 mg/mL时，此时硫磺菌醇提物对羟自由基的清除率达到最大值（75.88%±4.86%）。在相同质量浓度下，硫磺菌醇提物对羟自由基的清除作用小于水溶性维生素E。硫磺菌醇提物的羟自由基清除率EC50值为3.81 mg/mL。

图3 硫磺菌醇提物对羟自由基的清除能力

2.4 硫磺菌醇提物清除超氧阴离子自由基的测定

如图4所示，当质量浓度为0.50～8 mg/mL时，水溶性维生素E和硫磺菌醇提物对超氧阴离子的清除能力呈现逐渐增强的趋势。当质量浓度为8 mg/mL时，硫磺菌醇提物对超氧阴离子的清除率为50.84%± 4.86%。在相同质量浓度下，硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除率低于水溶性维生素E。硫磺菌醇提物的超氧阴离子自由基清除率EC50值为7.31 mg/mL。

图4 硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5 硫磺菌醇提物还原能力的测定

如图5所示，当质量浓度为0.31～5.00 mg/mL时，水溶性维生素E和硫磺菌醇提物的还原力呈现出逐渐增强的趋势。随着硫磺菌醇提物的溶液浓度逐渐增加，其还原能力也随之逐步提升。当质量浓度为5.00 mg/mL时，硫磺菌醇提物的还原力为0.47。在相同质量浓度下，硫磺菌醇提物的还原力小于水溶性维生素E。

图5 硫磺菌醇提物还原能力

2.6 硫磺菌醇提物活性成分分析

硫磺菌醇提物中的多糖、多酚、黄酮和三萜含量如表1所示。由表1可知，硫磺菌醇提物中含有多糖（117.08±5.46 mg/g）、多酚（21.29±0.25 mg/g）、黄酮（8.28±0.40 mg/g）和三萜（19.29±1.22 mg/g）。硫磺菌醇提物中活性成分的含量依次为多糖＞多酚＞三萜＞黄酮。

表1 硫磺菌醇提物活性物质含量 单位：mg/g

3 结论

硫磺菌具有丰富的食用价值和药用价值。已有研究表明，硫磺菌具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和降血脂等作用[16-17]。张凤丽等[18]研究发现多孔菌科灵芝的醇提物能够有效清除DPPH、ABTS和羟自由基。胡金霞等[19]研究发现桑黄醇提物对超氧阴离子自由基具有抑制的作用。李巍等[20]研究发现硫磺菌提取物具有抗氧化活性，硫磺菌的不同极性提取物（石油醚、氯仿、甲醇和乙酸乙酯提取物）能够有效清除自由基ABTS和DPPH自由基。此研究发现硫磺菌醇提物具有清除羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的活性。该研究结果与李巍等[20]的研究结果相一致。由此可知，硫磺菌具有清除自由基的作用。

此研究采用无水乙醇浸提的方法获得硫磺菌醇提物，分析了硫磺菌醇提物的活性物质含量。通过测定羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力及结合评估其还原力，从而综合评价硫磺菌醇提物的抗氧化活性。研究结果表明：硫磺菌醇提物对DPPH、ABTS、羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除作用，且表现出一定的还原能力。硫磺菌醇提物的清除作用的效果依次是ABTS＞DPPH＞羟自由基＞超氧阴离子自由基。硫磺菌醇提物中的多糖含量最高（117.08±5.46 mg/g），黄酮含量最低（8.28±0.40 mg/g）。由此可知，硫磺菌具有开发为天然食品抗氧化剂的潜力，该研究能够为硫磺菌精深加工提供理论基础。