硫磺菌醇提物抗氧化活性及其成分分析

2024-03-19 12:30杨晶晶池延添易永旺林国峰曾亮魏奇
食品工业 2024年2期
关键词:超氧提物硫磺

杨晶晶,池延添,易永旺,林国峰,曾亮,魏奇

1.宁德师范学院生命科学学院 (宁德 352100);2.福建省科技厅产学研合作示范基地 (宁德 352100);3.闽东特色生物资源福建省高校工程研究中心 (宁德352100)

硫磺菌(Laetiporussulphureus)是一种食药两用的大型真菌[1]。硫磺菌主要生长在针叶树和橡树等阔叶树的茎上[2]。硫磺菌富含多糖、氨基酸、甾醇类化合物等活性物质,并具有多种药用功效。已有研究表明硫磺菌能够抑制肺癌细胞的生长,并且能够有效抑制病原菌的生长,如小麦赤霉、金黄色葡萄球菌、黑根霉等[3]。硫磺菌所产生的甲酸酯物质对机体代谢调节具有十分重要的作用[4]。

自由基会对机体的细胞和组织造成损伤,进而引起机体的衰老和一系列慢性疾病的发生。已有研究表明阿尔兹海默症、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和衰老等疾病与自由基有关[5]。人工合成的抗氧化剂具有毒副作用,对人体具有不利影响[6]。因此,从植物中开发天然抗氧化剂,能够有效延长食品的贮藏期。

此研究以硫磺菌为原料,探究硫磺菌醇提物的体外抗氧化活性,同时测定了硫磺菌醇提物的多糖、总酚、黄酮和三萜含量。此研究能够促进天然食品抗氧化剂的进一步开发。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 原料与试剂

试验原料:硫磺菌(宁德师范学院生命科学学院生物活性物质研究实验室)。

水溶性维生素E、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、芦丁、齐墩果酸、2,2-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐(ABTS)、没食子酸(北京索莱宝科技有限公司);水杨酸、葡萄糖、无水乙醇、硫酸、亚硝酸钠、氯乙酸、硫酸亚铁、磷酸钠缓冲液和铁氰化钾等(国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.2 仪器与设备

DHG-9070A鼓风干燥箱、HWS-24恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);N-1300旋转蒸发仪(日本Tokyo Rikakikai公司);SHZ-DⅢ 循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);BO-250T高速多功能粉碎机(永康铂欧五金厂);SPectra Max i3X多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

将硫磺菌子实体置于65 ℃烘箱中烘干、粉碎、过筛。称取100 g硫磺菌粉末,按料液比1∶10 g/mL加入无水乙醇,在85 ℃水浴锅中提取3 h,去除残渣,收集滤液。滤液用旋转蒸仪去除乙醇,经真空干燥后得硫磺菌醇提物。

1.2.2 硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除作用

参照陈晓宁等[7]的方法测定硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的能力,以水溶性维生素E为阳性对照。DPPH(8 mg)溶解于无水乙醇中(40 mL),置于超声清洗器中处理5 min。测定DPPH溶液在波长519 nm处的吸光度,用无水乙醇调至1.2。硫磺菌醇提物的质量浓度为125,250,500,1 000和2 000 mg/mL。将相同体积的DPPH溶液和样品溶液(100 μL)混匀后,置于暗室反应30 min,测定波长519 nm处的吸光度,记为A1,相同操作条件下获得A2和A0。DPPH自由基清除率按式(1)计算。

式中:A1为样品与DPPH反应的吸光度;A2为无水乙醇代替DPPH的吸光度;A0为无水乙醇代替样品的吸光度。

1.2.3 硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除作用

参照齐睿婷[8]的方法测定硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的能力,以水溶性维生素E为阳性对照。将相同体积的过硫酸钾溶液(2.6 mmol/L,10 mL)和ABTS溶液(7.4 mmol/L,10 mL)混匀后,置于暗室反应12 h。硫磺菌醇提物的质量浓度为62.5,125,250,500和1 000 μg/mL。ABTS溶液在波长734 nm处的吸光度调至0.7。将相同体积的ABTS溶液和样品溶液(100 μL)混匀后,置于暗室反应6 min,测定波长734 nm处的吸光度,记为A1,相同操作条件下,获得A2和A0。ABTS自由基清除率按式(2)计算。

式中:A1为样品与ABTS反应的吸光度;A2为蒸馏水代替ABTS的吸光度;A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.4 硫磺菌醇提物对羟自由基的清除作用

参照颜军等[9]的方法测定硫磺菌醇提物清除羟自由基的能力,以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.5,1,2,4和8 mg/mL。将相同体积的水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L,1 mL)、样品溶液,FeSO4溶液(9 mmol/L,1 mL)和H2O2溶液(9 mmol/L,1 mL)混匀后,置于37 ℃恒温培养箱中反应30 min。测定波长510 nm处的吸光度,记为A1,相同操作条件下,获得A2和A0。羟自由基清除率按式(3)计算。

式中:A1为样品组的吸光度;A2为蒸馏水代替H2O2的吸光度;A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.5 硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基清除作用

参照谭亮等[10]的方法测定硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除能力,以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.5,1.0,2.0,4.0和8.0 mg/mL。将5 mL Tris-HCl(0.05 mol/L,pH 8.2)和5 mL样品溶液混匀后,于25 ℃水浴中静置20 min。加入0.4 mL邻苯三酚溶液(10 mmol/L)混匀后,于25 ℃静置5 min。再加入0.2 mL盐酸溶液(12 mol/L)终止反应。测定波长325 nm处的吸光度,记为A1,相同操作条件下,获得A2和A0。超氧阴离子自由基清除率按式(4)计算。

式中:A1为样品组的吸光度;A2为蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度;A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.6 硫磺菌醇提物还原能力的测定

参照张晨[11]的方法测定硫磺菌醇提物还原能力,以水溶性维生素E为阳性对照。硫磺菌醇提物的质量浓度为0.31,0.63,1.25,2.50和5.00 mg/mL。于15 mL玻璃试管中分别加入2.5 mL样品溶液、2.5 mL磷酸钠缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6)、2.5 mL铁氰化钾溶液(10 mg/mL)混合均匀,在50 ℃条件下静置20 min,再加入2.5 mL三氯乙酸(100 mg/mL),混合均匀,离心(3 500 r/min,10 min)。取2.5 mL的上清液,加入2.5 mL蒸馏水和1 mL氯化铁溶液(1.0 mg/mL),混合均匀。测定波长700 nm处的吸光度,记为A1,相同操作条件下,获得A2和A0。还原力按式(5)计算。

式中:A1为样品组的吸光度;A2为样品组本底的吸光度;A0为蒸馏水代替样品的吸光度。

1.2.7 硫磺菌醇提物中多糖含量的测定

参照梁琰等[12]的方法测定多糖含量。葡萄糖标准溶液的质量浓度分别为0,100,200,300,400,500,600,700,800和900 μg/mL。在15 mL离心管中分别加入1 mL样品溶液,1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸,混匀,静置15 min,测定波长490 nm下的吸光度。葡萄糖的标准曲线为Y=0.004X+0.146 8(R2=0.999)。

1.2.8 硫磺菌醇提物中总酚含量的测定

参照陈龙等[13]的方法测定总酚含量。没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0,20,100,150,200,300,400,500和600 μg/mL。在15 mL离心管中分别加入200 μL样品溶液,800 μL蒸馏水和200 μL福林-酚,混合,避光静置6 min,再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL蒸馏水,混匀后置于暗室反应90 min,测定760 nm波长处的吸光度。没食子酸标准曲线为Y=0.001 8X+0.040 7(R2=0.992)。

1.2.9 硫磺菌醇提物中总黄酮含量的测定

参照杨文慧等[14]的方法测定总黄酮含量。芦丁标准溶液的质量浓度分别为0,20,100,150,200,300,400,500和600 μg/mL。在15 mL离心管中加入5 mL样品溶液和300 μL 的NaNO2溶液(5%),混匀后,避光静置6 min。加入300 μL的Al(NO3)3溶液(10%),混匀后,避光静置6 min。加入4.4 mL NaOH溶液(4%),混匀后,避光静置12 min,测定510 nm波长处的吸光度。芦丁的标准曲线为Y=0.003 5X-0.015 5(R2=0.997)。

1.2.10 硫磺菌醇提物中总三萜含量的测定

参照亓小妮[15]的方法测定总三萜的含量。齐墩果酸标准溶液的质量浓度分别为0,20,40,60,80和100 μg/mL。取0.5 mL样品溶液,在90 ℃条件下挥干,冷却后加入0.25 mL香草醛-醋酸溶液(5%),0.4 mL蒸馏水和1.5 mL高氯酸,于60 ℃水浴15 min,再加入2.5 mL冰醋酸,在540 nm波长处测定样品的吸光度。齐墩果酸的标准曲线为Y=0.007 2X-0.040 3(R2=0.997)。

1.3 数据分析

采用Excel统计软件进行数据分析,试验的重复次数为3次。应用SPSS 20软件进行显著性分析,P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的测定

如图1所示,当水溶性维生素E的质量浓度为125 μg/mL时,水溶性维生素E已经能够将DPPH自由基全部清除。硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除作用随其质量浓度的增加随之增强。当硫磺菌醇提物的质量浓度为2 000 μg/mL时,此时硫磺菌醇提物能够将DPPH自由基全部清除,其清除率为96.26%±0.42%。硫磺菌醇提物的DPPH自由基清除率EC50值为820.20 μg/mL。

图1 硫磺菌醇提物对DPPH自由基的清除能力

2.2 硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的测定

由图2可知,当质量浓度为62.50 μg/mL时,水溶性维生素E已经能够将ABTS自由基全部清除。硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除作用呈现上升趋势。当硫磺菌醇提物的质量浓度为1 000 μg/mL时,硫磺菌醇提物已经能够将ABTS自由基基本清除,其清除率为94.27%±2.27%。硫磺菌醇提物的ABTS自由基清除率EC50值为317.09 μg/mL。

图2 硫磺菌醇提物对ABTS自由基的清除能力

2.3 硫磺菌醇提物清除羟自由基的测定

由图3可知,随着水溶性维生素E和硫磺菌醇提物质量浓度的增加,其对羟自由基的清除率呈现出逐渐增强的趋势。当硫磺菌醇提物的质量浓度为8 mg/mL时,此时硫磺菌醇提物对羟自由基的清除率达到最大值(75.88%±4.86%)。在相同质量浓度下,硫磺菌醇提物对羟自由基的清除作用小于水溶性维生素E。硫磺菌醇提物的羟自由基清除率EC50值为3.81 mg/mL。

图3 硫磺菌醇提物对羟自由基的清除能力

2.4 硫磺菌醇提物清除超氧阴离子自由基的测定

如图4所示,当质量浓度为0.50~8 mg/mL时,水溶性维生素E和硫磺菌醇提物对超氧阴离子的清除能力呈现逐渐增强的趋势。当质量浓度为8 mg/mL时,硫磺菌醇提物对超氧阴离子的清除率为50.84%± 4.86%。在相同质量浓度下,硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除率低于水溶性维生素E。硫磺菌醇提物的超氧阴离子自由基清除率EC50值为7.31 mg/mL。

图4 硫磺菌醇提物对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5 硫磺菌醇提物还原能力的测定

如图5所示,当质量浓度为0.31~5.00 mg/mL时,水溶性维生素E和硫磺菌醇提物的还原力呈现出逐渐增强的趋势。随着硫磺菌醇提物的溶液浓度逐渐增加,其还原能力也随之逐步提升。当质量浓度为5.00 mg/mL时,硫磺菌醇提物的还原力为0.47。在相同质量浓度下,硫磺菌醇提物的还原力小于水溶性维生素E。

图5 硫磺菌醇提物还原能力

2.6 硫磺菌醇提物活性成分分析

硫磺菌醇提物中的多糖、多酚、黄酮和三萜含量如表1所示。由表1可知,硫磺菌醇提物中含有多糖(117.08±5.46 mg/g)、多酚(21.29±0.25 mg/g)、黄酮(8.28±0.40 mg/g)和三萜(19.29±1.22 mg/g)。硫磺菌醇提物中活性成分的含量依次为多糖>多酚>三萜>黄酮。

表1 硫磺菌醇提物活性物质含量 单位:mg/g

3 结论

硫磺菌具有丰富的食用价值和药用价值。已有研究表明,硫磺菌具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和降血脂等作用[16-17]。张凤丽等[18]研究发现多孔菌科灵芝的醇提物能够有效清除DPPH、ABTS和羟自由基。胡金霞等[19]研究发现桑黄醇提物对超氧阴离子自由基具有抑制的作用。李巍等[20]研究发现硫磺菌提取物具有抗氧化活性,硫磺菌的不同极性提取物(石油醚、氯仿、甲醇和乙酸乙酯提取物)能够有效清除自由基ABTS和DPPH自由基。此研究发现硫磺菌醇提物具有清除羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的活性。该研究结果与李巍等[20]的研究结果相一致。由此可知,硫磺菌具有清除自由基的作用。

此研究采用无水乙醇浸提的方法获得硫磺菌醇提物,分析了硫磺菌醇提物的活性物质含量。通过测定羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力及结合评估其还原力,从而综合评价硫磺菌醇提物的抗氧化活性。研究结果表明:硫磺菌醇提物对DPPH、ABTS、羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除作用,且表现出一定的还原能力。硫磺菌醇提物的清除作用的效果依次是ABTS>DPPH>羟自由基>超氧阴离子自由基。硫磺菌醇提物中的多糖含量最高(117.08±5.46 mg/g),黄酮含量最低(8.28±0.40 mg/g)。由此可知,硫磺菌具有开发为天然食品抗氧化剂的潜力,该研究能够为硫磺菌精深加工提供理论基础。

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