离子液体辅助微波提取紫苏梗中的黄酮

闫平，王诗媛，张彦，严惠仲，同红娟，柴希艳

1.西安医学院 （西安 710021）；2.西安风吹麦浪农产品技术开发有限公司 （西安 710065）；3.西安雨润百德健康管理有限公司 （西安710065）

紫苏[Perillafrutescens（L.）Britt.]是药食同源的植物[1-2]。紫苏叶近年来用以制作咸菜，紫苏籽用来榨油，而紫苏梗和花托、残叶常作为农产品废弃物被焚烧或还田处理[1-2]。其实紫苏籽、梗、叶等不同部位均可作为药材使用[3-5]。紫苏梗有理气宽中、止痛、安胎的功效，用于治疗胸膈痞闷、胃脘疼痛、嗳气呕吐、胎动不安[6]。紫苏籽、梗、叶中均含有黄酮、黄酮苷类化合物[3-5]，近年来紫苏黄酮的提取研究多集中在紫苏籽与紫苏叶上，鲜有紫苏梗中黄酮的提取与富集的研究[3-6]。

传统提取黄酮的主要方法是有机溶剂提取，提取效率不高，资源利用度低，溶剂用量大，耗时[7]。离子液体（ionic liquid）是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的熔融盐，有绿色环保、性质稳定、便于重复利用、萃取率高、可设计性强等特点，可减少萃取分离过程中的环境污染，同时可显著提高提取率[7-8]。微波辅助提取技术在天然产物的提取中已得到广泛应用，具有提取率高、溶剂损耗少、时间较短、无醇不溶残留等特点[9]。试验运用微波辅助离子液体提取紫苏梗中黄酮类化合物。将两者相结合，不但利用离子液体的独特的性质，而且弥补传统提取法的不足，达到高效低耗、节约成本的效果。试验用响应曲面设计确定最佳提取条件。采用HPLC检测提取的紫苏梗中相应主成分含量，分析不同方法提取出来的黄酮的主成分的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

紫苏梗为唇形科植物紫苏[Perillafrutescens（L.）Britt.]除去花叶花托的干燥茎，由杨凌子苏生物科技有限公司提供，由郑梦迪和汪兴军共同鉴定。

1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（批号CP061097，兰州奥力科精细化学品技术有限公司）；六氟磷酸钾（批号P815654，纯度99%，上海麦克林生化科技股份有限公司）；芦丁（批号B20771，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；咖啡酸（批号HR15313S1，纯度≥98%）、木犀草苷（批号HS09192B1，纯度≥98%）、迷迭香酸（批号HR213S01，纯度≥98%），均由宝鸡晨光生物科技有限公司提供；甲醇（纯度≥99.9%，Oceanpak）；甲酸（GC级≥98%，aladdin）；亚硝酸钠（天津市巴斯夫化工有限公司）；硝酸铝和氢氧化钠（沈阳化学试剂厂）；所用水均为蒸馏水。

XH-300A型微波超声波组合合成萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；1220型液相色谱仪（Agilent公司）；SQP型分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；755s型紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司）；TDL-40B型医用离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；1510型全波长酶标仪（昆山市超声仪器有限公司）；等。

1.2 方法

1.2.1 紫苏梗中黄酮的提取1.2.1.1 离子液体提取方法[10]

取2.0 g孔径0.150 mm（100目）筛的紫苏梗，加入1 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑溴盐离子液体与70%乙醇混合溶液至设定的料液比例，设定微波输出功率，在规定的温度下提取至设定时间后，得到粗提液。将5 g六氟磷酸钾加50 mL蒸馏水完全溶解后室温放置至沉淀不再增加时过滤即得饱和六氟磷酸钾溶液[10]。取上粗提液与饱和六氟磷酸钾溶液，按体积比1∶1混合后静置4 h，待六氟磷酸钾与离子液体形成复合盐沉淀，在3 000 r/min转速下离心10 min，取上清液[10]，即得去除离子液体的总黄酮样品溶液。

1.2.1.2 传统提取方法

取2.0 g孔径0.150 mm（100目）筛的紫苏梗，与70%乙醇混合形成料液比1∶20（g/mL）的混合溶液，在100 ℃下回流提取6 h后得到传统方法下的样品溶液[11-12]。

1.2.2 总黄酮的富集

参照文献方法[13-14]将大孔树脂D101预处理后，取1.2.1小节的离子液体提取方法中去除离子液体的总黄酮样品溶液上清液，用70%乙醇稀释后上样到大孔树脂D101的层析柱中，充分吸附，用水洗脱，洗至洗脱液无色并用浓硫酸检测不出糖，用60%乙醇洗脱至FeCl3检测呈阴性，分别收集水流出液和醇洗脱液，将醇洗脱液旋蒸至无醇味。

1.2.3 总黄酮含量测定

以芦丁标准液，参照文献方法[10,15]，采用AlCl3-NaNO2-NaOH显色法于510 nm波长处测定吸光度，绘制芦丁标准曲线。将1.2.2小节富集后得到的提取液用蒸馏水定容100 mL容量瓶中，作为供试品试液。重复以上操作，测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算黄酮的浓度。

1.2.4 紫苏梗总黄酮提取单因素考察

以紫苏梗提取液中的总黄酮提取率为指标，设定70%乙醇与离子液体体积比（简称离子液体体积比）分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，微波功率分别为150，350，550，750和950 W，原料粉末与提取液比（简称料液比）分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），温度分别为40，50，60，70和80 ℃，进行单因素试验，确定适宜条件[10]。

1.2.5 紫苏梗总黄酮提取响应曲面设计

在单因素试验基础上，选取3个对紫苏梗提取液中总黄酮提取率影响较大的因素，即料液比、离子液体体积比、微波功率。以3个因素为自变量（X），以黄酮提取率为响应值（Y），使用Design-Expert 8.0.6软件，依据Box-Behnken Design原理进行三因素三水平响应面试验设计，对提取条件进行优化[10,16]。试验因素与水平见表1。

表1 紫苏梗提取响应面因素水平表

1.2.6 高效液相测定

1.2.6.1 色谱条件

参考文献[5,17]，AgiLent5 HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。流动相为甲醇（B）-0.1%甲酸溶液（A）；波长335 nm。梯度洗脱条件：0～15 min，30%甲醇-0.1%甲酸水70%；15～35 min，51%甲醇-0.1%甲酸水49%；35～65 min，80%甲醇-0.1%甲酸水20%。

1.2.6.2 混合对照品溶液的制备

精密称取6.30 mg咖啡酸、2.01 mg木犀草苷、10.6 mg芦丁、3.92 mg迷迭香酸，加甲醇定容至10 mL，制得不同质量浓度的混合液，摇匀，即得，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

1.2.6.3 供试品溶液的制备

将制备0.016 mg/mL的紫苏梗提取液摇匀，使用时过0.45 μm微孔滤膜备用，即得。

1.2.6.4 进样

取10 μL制备的紫苏梗提取液，进样，测定咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的峰面积，测定其含量。

1.2.7 方法学考察

1.2.7.1 线性关系考察

精密吸取5，10，12和15 μL 1.2.6小节的混合对照品溶液，进样，按1.2.6小节的色谱条件进样分析，以进样量为横坐标，含量为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算[5,17]。

1.2.7.2 精密度试验[5,17]

精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的峰面积SRSD。

1.2.7.3 稳定性试验[5,17]

精密吸取10 μL同一批供试品溶液，于0，2，4，8，12，16，24和36 h进样，按1.2.6小节的色谱条件测定其峰面积，计算得到咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的SRSD。

1.2.7.4 重复性试验[5,17]

取同一批次供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的峰面积SRSD。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

取质量浓度分别为0.008，0.016，0.024，0.032，0.040和0.048 mg/mL的芦丁标准溶液各200 μL加入到96孔板，用酶标仪测量510 nm波长下的吸光度。以芦丁标品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，如图1所示。芦丁标准曲线方程为Y=3 535.7X，R2=0.997 3。

图1 芦丁标准曲线

2.2 紫苏梗总黄酮提取单因素考察

2.2.1 微波功率

取2.0 g紫苏梗粉末，离子液体体积比30∶1，料液比1∶20（g/mL），提取温度50 ℃，反应时间8 min，微波功率分别为150，350，550，750和950 W，考察微波功率对黄酮提取率的影响。按照上述条件所得的提取液中黄酮提取率分别为0.59%，0.62%，0.71%，0.84%和0.75%。

由图2可知，随着微波功率的增加，紫苏梗总黄酮提取率增加，微波功率750 W时黄酮提取率最高，750 W之后提取率反而变低，原因可能是微波功率过大使温度上升太快，进而使黄酮稳定性降低。对紫苏梗总黄酮提取的微波功率均选择750 W。

图2 微波功率对紫苏梗黄酮提取率的影响

2.2.2 提取温度

取2.0 g紫苏梗粉末，70%乙醇与离子液体体积比20∶1，料液比1∶25（g/mL），微波功率750 W，反应时间8 min，提取温度分别为40，50，60，70和80 ℃，考察反应温度对黄酮提取率的影响。按照上述条件所得的黄酮提取率分别为1.19%，1.25%，1.34%，1.35%和1.29%。

由图3可知，随着温度的增加，黄酮提取率增加，70 ℃时黄酮提取率最高，继续升高温度，黄酮提取率反而下降，原因可能是温度太高使黄酮稳定性降低。且由图3可知，温度升高对黄酮提取率的影响不大。此后提取温度均选择70 ℃。

图3 提取温度对紫苏梗黄酮提取率的影响

2.2.3 料液比

取2.0 g紫苏梗粉末，离子液体体积比20∶1，反应温度70 ℃，微波功率750 W，反应时间8 min，料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），考察料液比对黄酮提取率的影响。按照上述条件所得的黄酮提取率分别为0.72%，1.07%，0.78%，0.52%和0.44%。

由图4可知，料液比达到1∶20（g/mL）时，黄酮提取率最高。液料比继续增大时，过多的提取剂会使微波能量传递减弱，使植物细胞破裂不完全，黄酮无法充分溶解，导致提取率下降。

图4 料液比对紫苏梗黄酮提取率的影响

2.2.4 离子液体体积比

取2.0 g紫苏梗粉末，料液比1∶20（g/mL），微波功率750 W，提取温度70 ℃，反应时间8 min，70%乙醇与离子液体体积比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，考察离子液体体积比对黄酮提取率的影响。按此条件所得的黄酮提取率分别为1.01%，1.09%，0.95%，0.72%和0.69%。

由图5可知，离子液体体积比10∶1时提取率最高，体积比接着增大时离子液体的相对浓度降低，萃取效率降低。

图5 离子液体体积比对紫苏梗黄酮提取率的影响

2.3 紫苏梗总黄酮提取响应曲面设计

按照单因素试验结果，以黄酮提取率为响应值，设计三因素三水平试验，根据软件设计17组试验方案并完成测定，结果见表2。微波功率（A）、料液比（B）、离子液体体积比（C）与提取率（Y）之间的线性回归方程为Y=-0.068 280+0.002 131A+1.588 670B+0.011 854C+0.000 286AB+0.000 007AC-0.022 857BC-0.000 002A2-11.561 220B2-0.000 854C2。

表2 紫苏梗响应曲面试验方案及结果

由图6～图8可知，响应曲面预测的最佳工艺条件为微波功率750 W、料液比1∶28.35（g/mL）、离子液体体积比11.77∶1、温度70 ℃，在该最佳工艺条件下提取紫苏梗黄酮的提取率预测值为0.187 206%。

图6 微波功率、料液比的响应曲面与等高曲线图

图7 微波功率、离子液体体积比的响应曲面与等高线图

图8 料液比、离子液体体积比的响应曲面与等高线图

对该模型方程进行方差分析和显著性检验，结果显示，回归方程模型F值为45.05，P值小于0.000 1，表明模型显著，响应面试验的回归方程预测紫苏梗中的黄酮提取率可行。由P值可知，在此试验范围内的3个因素对提取率的影响大小顺序为微波功率（A）＞离子液体体积比（C）＞料液比（B），因素A、C、A2、B2、C2对提取效果的线性效应均显著，见表3。

表3 黄酮提取率模型的显著性检验及方差分析

按照响应面预测最佳工艺条件，采取微波功率750 W、料液比1∶30（g/mL）、离子液体体积比12∶1、温度70 ℃条件进行3次平行试验，3次平行试验提取率分别为0.188%，0.176%和0.184%，平均提取率0.183%，与预测值0.187 206%基本吻合，说明响应面设计方案合理。

2.4 HPLC法测定主成分含量

2.4.1 方法学考察结果

2.4.1.1 线性关系

各标准品的回归曲线、相关系数、线性范围见表4。

表4 各标准品的回归曲线、相关系数、线性范围

2.4.1.2 精密度试验

咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的峰面积SRSD分别为3.27%，3.04%，3.36%和4.52%，表明仪器精密度良好。

2.4.1.3 稳定性试验

咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的SRSD为0.23%，0.19%，0.41%和0.18%，表明供试品溶液在36 h之内稳定性良好。

2.4.1.4 重复性试验

咖啡酸、木犀草苷、芦丁、迷迭香酸的峰面积SRSD分别为0.26%，0.19%，0.49%和0.19%，表明该方法重复性较好。

2.4.2 含量测定

取制备的紫苏梗样品，按照1.2.6小节的色谱条件进样测定的峰面积，运用外标一点法测定其含量，计算得到含量测定结果，见表5。主成分高效液相色谱图见图9。

图9 主成分高效液相色谱图

表5 紫苏梗部分主成分含量测定 单位：mg/g

由表5可知，离子液体辅助微波提取的黄酮中木犀草苷和芦丁比传统方法含量均高，说明该方法切实可行。此外，《药典》中规定的紫苏梗的指标性成分迷迭香酸的含量也高于传统方法[18]。

3 结论与讨论

使用响应面设计优化提取工艺，该模型应用随机过程的统计学试验方法，同时采用微波提取作为提取手段，有提取溶剂用量少、时间较短、节能环保等特点[19]，离子液体为辅助提取溶剂，具有提取率高、溶剂损耗少的特点[20]。新方法即离子液体辅助微波提取比传统方法总黄酮主成分提取率高。最佳工艺为微波功率750 W，料液比1∶30（g/mL），离子液体体积比12∶1，温度70 ℃，在该最佳工艺下提取紫苏梗黄酮的提取率预测值为0.187 206%。经试验验证黄酮平均提取率为0.183%，与预测值接近，说明响应面设计方案合理。按照新方法提取得到的紫苏提取物中紫苏中具有抗氧化、抗肿瘤等活性的黄酮成分木犀草苷和芦丁含量均高于传统方法，且酚酸类主成分迷迭香酸和咖啡酸也高于传统方法[21-22]。因此，试验所优化的最佳提取方案可行，将微波辅助离子液体运用于紫苏梗黄酮提取的方法可行。

提取黄酮类化合物采用的离子液体主要是烷基咪唑盐类，其中以1-丁基-3-甲基咪唑盐类居多。苏适等[24-25]以1-丁基-3-甲基咪唑氯盐离子液体为提取剂，采用超声波辅助提取黑豆异黄酮；微波辅助离子液体提取黑豆皮花青素，且提取率均大于传统方法。潘思源等[26]进行了微波辅助离子液体提取法与传统提取方法对罗布麻叶总黄酮的提取研究，结果表明微波离子液体法比微波乙醇法和乙醇热回流法所得的总黄酮提取量均高。

试验具有一定创新性。离子液体作为一种绿色环保溶剂，减少能耗，有助于植物黄酮的提取[19]。试验使用的咪唑类离子液体可作为提取剂用于植物中多种活性物质如生物碱类、黄酮类、果胶、色素、植物内酯等的提取[20]。试验具有一定的应用价值。紫苏梗作为农产品废弃物被丢弃或焚烧，紫苏梗富含木质纤维素和高附加值天然活性物质，现处置方式多为焚烧或直接还田，造成紫苏梗中天然活性物质丧失[23]，既污染环境又造成浪费。试验实现从紫苏梗中提取与富集黄酮，为高效环保开发利用这种生物活性成分提供切实可行的解决方案，填补国内空白，可实现农副产品的综合利用。采用新型绿色的有机溶剂离子液体提取，为农产品废弃物中活性成分的提取与后期的综合利用与开发提供新思路。

试验仍存在不足，未完全阐明离子液体提取黄酮的具体原理。猜测可能与化合物的极性和离子液体的结合方式有关，也可能与化合物中酚羟基含量有关，还可与离子液体黏度及传质效果有关，溴离子与被提取物之间可能产生多重相互作用[10]。紫苏梗中富含纤维素[23]，后期可加上生物酶解的步骤，先分解其中的纤维素，可能更能提高紫苏黄酮的提取率。另外，紫苏中黄酮苷类主要以野黄芩素、木犀草素、芹菜素为母核的单糖及二糖葡萄糖醛酸苷类成分为主[21-22]，该类成分的高效提取有待后续深入研究。