牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白表达水平的影响

吕明其, 陈颖清, 吴晓晴, 李 健, 廖吕燕, 吴樟强, 黄一帆, 马玉芳

[1.重庆医科大学实验教学管理中心,重庆 400016;2.中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室,福建 福州 350002;3.福建省兽医中药与动物保健重点实验室(福建农林大学),福建 福州 350002;4.福建省中农牧生物药业有限公司,福建 龙岩 364099]

牛至味辛、性凉,有清热解表、理气化湿和利尿消肿之功效,曾收载于《中华人民共和国药典》(1977年版)中[1]。牛至香酚是从牛至中提取的一种挥发性植物精油,主要成分有百里香酚、香芹酚、γ-萜品烯和p-异丙甲苯等酚类化合物[2-3]。研究表明,牛至香酚有促生长[4-5]、增强机体免疫力[6-7]、抗氧化[8]和抗肿瘤[9]等功效。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)为革兰氏阴性菌膜结构物质,是一种内毒素,能通过靶细胞上的Toll样受体的信号转导作用激活单核、巨噬细胞浆内核转录因子κB,使炎性介质大量释放引起内毒素积聚造成肠道上皮细胞受损、肠道通透性增强[10-11]。本课题组前期研究表明,牛至香酚能通过调节免疫应激小鼠脾脏核转录因子和细胞因子mRNA的表达水平,减轻LPS对脾脏造成的免疫应激损伤[12]。但牛至香酚对免疫应激小鼠肠道细胞因子和紧密连接相关跨膜蛋白、胞质附着蛋白mRNA表达水平的影响却鲜见报道。据此,本研究探讨牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响,旨在探讨牛至香酚对LPS免疫应激小鼠的免疫调节机理,丰富牛至香酚免疫药理学内容,为其进一步的开发应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 健康雄性清洁级昆明(KM)小鼠体质量(22±2) g,购自福建医科大学实验动物中心。动物试验通过了福建农林大学学术委员会动物实验伦理审查(审批号:PZCASFAFU21008) 。

1.1.2 试剂 牛至香酚由福建省中农牧生物药业有限公司惠赠,其中,百里香酚和香芹酚的含量为67%;注射用LPS购自Sigma公司;ELISA试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司;RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司。

1.1.3 仪器与设备 主要仪器与设备有独立送回风净化笼具(苏州市苏杭科技器材有限公司)、电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、SW-CJ-1F型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)、ALLEGRA X-22R型冷冻离心机(美国贝克曼公司)、CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)、SK-1快速混匀器(金坛市科析仪器有限公司)。

1.2 试验动物分组与处理

将80只小鼠适应性饲养1周后随机分成5组,分别为空白对照组,模型组和牛至香酚低、中、高剂量组,每组16只。所有小鼠均自由饮水、采食。牛至香酚低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg·kg-1的剂量灌胃牛至香酚,空白对照组和模型组按10 mL·kg-1的剂量灌胃橄榄油,每日1次,连续14 d。第15天时,牛至香酚试验组和模型组均按8 mg·kg-1的剂量腹腔注射LPS,空白对照组注射等量生理盐水。

1.3 样品采集与处理

腹腔注射LPS 6 h后,将小鼠的眼球摘去并采集血液,分离血清;采用颈椎脱臼法处死小鼠,将取出的回肠和结肠组织装入经DEPC水处理后的Eppendorf管中,置于-80 ℃冻存备用。

1.4 小鼠血清细胞因子含量的检测

采用ELISA试剂盒检测小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。

1.5 小鼠肠道细胞因子和紧密连接蛋白mRNA表达水平的RT-PCR检测

采用RT-PCR检测小鼠回肠和结肠组织细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β)和紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)mRNA的相对表达量。

1.5.1 RNA的提取 将肠道组织放入1.5 mL去酶管中,于冰上研磨,加入1 mL RNAiso Plus,混匀后用离心管分装为两管,室温下静置5 min;向每个离心管中加入200 μL氯仿,振荡至液体乳化呈乳白色,室温下静置3 min后于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min;将上清液转移至新的离心管中,加入等体积的异丙醇,室温下静置10 min;于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,弃上清液,加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀,于4 ℃、7 500 r·min-1离心5 min,弃上清液。RNA沉淀在室温下放置干燥后,加入20 μL Rnase Free dH2O溶解RNA,测定RNA的浓度和纯度。

1.5.2 反转录 反转录体系为:2 μL 5×Prime Script Buffer、0.5 μL Rimescript RT Enzyme Mix×1、0.5 μL Ligo dT Primer(50 μmol·L-1)、0.5 μL Andom 6 Mers(10 μmol·L-1)、1 μL Total RNA、5.5 μL Rnase Free dH2O。反转录程序为:37 ℃,15 min(反转录反应);85 ℃,5 s(反转录酶失活反应);4 ℃下保存。

按照cDNA反转录试剂盒说明书的步骤将提取的RNA反转录成cDNA,按照SYBR Premix EXTaqTM试剂盒说明书的步骤测定肠道细胞因子和紧密连接蛋白mRNA的相对表达量。

1.5.3 RT-PCR检测 RT-PCR反应体系为:0.25 μL正向引物、0.25 μL反向引物、6.25 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1 μL cDNA、4.75 μL灭菌蒸馏水。扩增条件为:95 ℃预变性120 s;95 ℃变性5 s,62 ℃退火30 s,38个循环;65 ℃延伸5 s。经过相应条件扩增后,以β-actin为内参基因,每个样本进行3次重复。采用相对定量法测得样品的Ct值,采用2-ΔΔCt法计算各因子mRNA的相对表达量。引物序列及扩增长度如表1所示。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RT-PCR引物序列及扩增长度Table 1 RT-PCR primer sequence and product size

1.6 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示;采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析;采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量的影响

由表2可知,与空白对照组相比,模型组小鼠血清IL-6含量极显著上升(P<0.01),IL-1β、TNF-α含量上升(P>0.05)。表明LPS导致小鼠机体炎症因子含量增加,造成炎性损伤。与模型组相比,牛至香酚试验组小鼠血清IL-6含量极显著下降(P<0.01),IL-1β含量显著下降(P<0.05);牛至香酚中、高剂量组IL-10含量显著上升(P<0.05);牛至香酚高剂量组TNF-α含量极显著下降(P<0.01)。表明牛至香酚可有效抑制LPS所致的致炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,减轻机体炎症反应。

表2 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量的影响1)Table 2 Effect of oregano phenol on serum cytokine levels in mice with LPS-induced immune stress ρ/(ng·mL-1)

2.2 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠回肠组织细胞因子mRNA表达水平的影响

由表3可知,与空白对照组相比,模型组小鼠回肠组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平极显著上调(P<0.01),IL-10 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。表明LPS导致回肠端炎症因子表达水平增高,造成回肠炎性损伤。与模型组相比,牛至香酚低、中剂量组小鼠回肠组织IL-1βmRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚试验组IL-6 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚低剂量组TNF-αmRNA表达水平显著下调(P<0.05),牛至香酚中、高剂量组TNF-αmRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚中剂量组IL-10 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);其余指标无统计学差异(P>0.05)。表明牛至香酚能减轻回肠端LPS造成的炎性损伤,降低炎性因子mRNA的表达水平。

表3 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠肠道组织细胞因子mRNA相对表达量的影响1)Table 3 Effect of oregano phenol on mRNA expression of intestinal cytokine in mice with LPS-induced immune stress

2.3 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠结肠组织细胞因子mRNA表达水平的影响

由表3可知,与空白对照组相比,模型组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01)。表明LPS导致结肠端炎性细胞因子增多,造成结肠炎性损伤。与模型组相比,牛至香酚试验组IL-1βmRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚低剂量组IL-6 mRNA表达水平显著下调(P<0.05);牛至香酚中、高剂量组IL-10 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);牛至香酚低、高剂量组TNF-αmRNA表达水平极显著下调(P<0.01)。表明牛至香酚能有效减轻LPS所致的结肠炎性损伤。

2.4 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠回肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响

由表4可知:模型组小鼠回肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05);与模型组相比,牛至香酚中、高剂量组ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01)。表明牛至香酚能修复LPS所致的回肠黏膜通透性损伤。

表4 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠肠道组织紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响1)Table 4 Effect of oregano phenol on mRNA expression of intestinal tight junction protein in mice with LPS-induced immune stress

2.5 牛至香酚对LPS免疫应激小鼠结肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响

由表4可知:与空白对照组相比,模型组小鼠结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01);ZO-1 mRNA表达水平下调,但无统计学差异(P>0.05)。表明LPS通过引发肠道炎症,导致结肠黏膜屏障发生改变。与模型组相比,牛至香酚试验组ZO-1 mRNA表达水平有所上调,但差异不显著(P>0.05);牛至香酚低剂量组OccludinmRNA表达水平显著上调(P<0.05),牛至香酚中、高剂量组OccludinmRNA表达水平极显著上调(P<0.01);牛至香酚高剂量组Claudin-1 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01)。表明牛至香酚能减轻结肠炎症损伤,提高结肠黏膜的通透性。

3 讨论

LPS诱发动物机体器官障碍综合征初见于肠道[13],通过诱导肠道上皮细胞发生炎症,破坏肠道屏障造成肠道通透性增强,内毒素更易透过肠道黏膜在肠道集聚导致炎性因子表达增多进而加重炎症反应[14]。

本研究结果表明,牛至香酚能下调LPS免疫应激小鼠回肠和结肠组织致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平,上调抗炎因子IL-10 mRNA的表达水平。这与LPS导致小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量减少,IL-10含量增多的结果一致。与空白对照组相比,模型组小鼠回肠和结肠组织致炎因子分泌显著增多,且牛至香酚能降低LPS引发的IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达水平,表明LPS诱导模型成功,不同剂量的牛至香酚均能缓解小鼠机体中LPS诱导的炎症反应。此结果与胡宇声[15]、常轶聪[16]的研究结果相似。胡宇声[15]研究表明,苦参露能通过抑制大鼠小肠上皮细胞和微血管内皮细胞TLR4、NF-κB信号通路的激活从而减少IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,缓解LPS诱导的炎症对小肠的损伤作用;常轶聪[16]研究表明,二氢杨梅素能缓解LPS引起的鸡肠道组织IL-6、TNF-αmRNA的表达水平。本研究中,牛至香酚试验组小鼠回肠和结肠组织炎症因子的表达水平与模型组相比存在不同的差异显著性,由于不同肠段组织对于同一来源LPS所引发的炎症反应存在差异,对不同剂量牛至香酚的耐受程度也不相同。牛至香酚试验组小鼠结肠组织IL-10 mRNA的表达水平高于模型组,致炎因子mRNA的表达水平均下调,表明在Treg细胞炎性反应中通过分泌IL-10反向调节从而起到抑制炎症的作用。中剂量牛至香酚能显著或极显著下调小鼠回肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平,上调IL-10 mRNA的表达水平,这与本课题组前期的研究结果[12]和惠永岗等[17]的研究结果相似。本课题组前期研究表明,牛至香酚能有效下调LPS免疫应激小鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平,上调IL-10 mRNA的表达水平[12];惠永岗等[17]研究表明,葡萄糖-胰岛素-钾极化液(GIK)试验组小鼠脾脏IL-10的表达水平高于模型组,IL-1β、TNF-α的表达水平低于模型组。前人研究还表明:香芹酚能下调大鼠肺脏组织TNF-α、IL-1β、IL-4的表达水平[18-19];百里香酚与迷迭香酸组合能显著降低大鼠空肠黏膜IL-6的表达水平,降低TNF-α的表达水平,显著提高IL-10的表达水平[20]。上述前人研究结果[18-20]与本研究结果相一致。本研究中,牛至香酚对小鼠血清和肠道促炎因子、抗炎因子的分泌产生作用,表明牛至香酚能通过降低IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达水平进而干预NF-kB信号通路。这可能是因为牛至香酚含有的百里香酚可调控NF-kB信号通路进而产生抗炎的功效[21-24];牛至香酚含有的香芹酚能抑制LPS诱导的致炎因子的产生与释放[25]。

肠道黏膜上皮细胞是肠腔内侧的单层细胞,是阻止病原微生物和内毒素进入机体的一道重要防线[26]。应激和损伤会破坏肠道黏膜屏障,此时肠道病原微生物异常增殖、毒素大量积聚,病原微生物和内毒素透过受损的肠道黏膜屏障进入机体引发全身性炎症反应。因此,肠道上皮细胞的增殖对维持肠道屏障的完整性十分重要[27]。研究表明,蛋白的功能主要取决于蛋白的相应结构[28],肠道紧密连接蛋白具有电荷选择性,是构建黏膜上皮细胞屏障的重要结构。Claudin和Occludin为跨膜蛋白。Claudin具有调节屏障结构和转运的功能,主要反映肠道上皮紧密连接的结构和功能状态;Occludin直接构建紧密连接的栅栏和屏障。研究表明,内毒素可通过调节炎症因子的表达水平从而影响ZO-1、Claudin、Occludin的表达水平,紧密连接蛋白的低表达水平导致肠道上皮细胞的屏障功能受损[29-32]。本研究结果表明,牛至香酚通过上调小鼠回肠和结肠组织ZO-1 mRNA的表达水平,修复LPS引发的肠道黏膜的屏障损伤。这与大黄素联合黄芩苷[33]及0.05%和0.1%二氢杨梅素[16]能上调ZO-1表达水平的结果相一致。本研究中,与空白对照组相比,模型组小鼠回肠组织OccludinmRNA的表达水平上调,表明LPS可能通过影响Occludin的转录后修饰破坏肠道上皮细胞屏障紧密连接的完整性,增强肠道通透性,导致炎症因子更容易通过肠壁进入体内;与空白对照组相比,模型组小鼠结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA的表达水平极显著下调,表明LPS引发炎症因子高表达从而破坏了肠道屏障结构,导致跨膜蛋白表达水平下降,肠道通透性增强,这与Jiang et al[34]的研究结果相似;与模型组相比,牛至香酚试验组小鼠结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA的表达水平上调,且OccludinmRNA的表达水平与牛至香酚含量相关,这与“甘草酸剂量依赖性抑制Occludin表达”的结果[35]相一致;与模型组相比,牛至香酚高剂量组小鼠回肠和结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA的表达水平极显著上调,这与“百里香酚与迷迭香酸组合能增强LPS攻毒大鼠肠道组织Claudin-1、OccludinmRNA的表达水平”的结果[20]相似,表明牛至香酚能通过增强LPS免疫应激小鼠肠道组织ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA的表达水平来维持肠道上皮细胞屏障功能的完整性。但牛至香酚的有效成分是如何影响紧密连接蛋白的结构和功能还需进一步研究。

本研究结果表明,牛至香酚通过调节LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白mRNA的表达水平,修复肠道黏膜屏障结构,缓解LPS对肠道组织造成的免疫应激损伤。