GC-MS结合自动解卷积技术分析谷壳中挥发性风味成分

毕荣宇，王国江，卢 君*，唐 平，山其木格，王 丽，王 凡，李长文，王道军，陆安谋

（1.贵州国台酒业集团股份有限公司，贵州 仁怀 564501；2.贵州国台酒业集团研究院，天津 300410）

谷壳，又名糠壳、稻壳，是稻谷加工过成中分离出来的外壳[1]，其主要成分为纤维素（35.5%～45.0%）、木质素（21%～26%）、灰分（11.4%～22.0%）、五碳糖聚合物（16%～21%）[2-3]。谷壳具有结构紧密、质地坚硬、不易分解、耐酸耐高温、良好的疏松度、不易与糟醅粘连等特性。利用这些特性，谷壳常用作固态大曲酒酿造的主要辅料，在大曲酱香型白酒的生产中用于糟醅和甑篦的隔离，堆积发酵时避免糟醅和晾堂地表的接触，避免窖面糟醅和窖泥的接触，加入糟醅中起到疏松、支撑、透气，调剂糟醅的淀粉浓度、酸度、水分含量的作用，使得酒醅有适宜的缝隙，为微生物生长和繁殖提供必要的氧气，利于蒸馏取酒和糟醅溶氧，提高堆积发酵质量，使蒸粮、糖化发酵、蒸酒顺利进行[1，3-5]。

由于谷壳在储存、运输过程中容易受潮发霉，随着储存时间的延长，霉菌量和脂肪酸值呈增加趋势，导致谷壳品质劣变。由于谷壳本身含有杂质、杂菌以及大量生糠味、青草味、泥腥味和苦味物质，因此，对白酒基酒的产量和质量有一定的影响[6-7]。酱香型白酒酿造过程中谷壳用量较大，因而在实际生产过程中需要预先将谷壳置于酒甑中利用清水进行敞口清蒸30 min左右，再拌和糟醅进行白酒蒸馏。目前，地方标准DB52/T 869—2014《酱香型白酒酿酒用谷壳》也只规定了水分、色泽和气味的检验方法及应用标准[8]。在实际生产中谷壳使用要求“既要有糠香又要有骨力”，但是目前谷壳在蒸馏前后香气特征的变化往往凭借操作工人的手感和闻香决定，这种评价具有极强的主观片面性[9]。因此，弄清谷壳中挥发性成分的构成信息，对科学控制异杂味向酒中的迁移，制定谷壳的使用标准有着积极的作用。

本研究基于顶空固相微萃取（head space solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）结合自动质谱解卷积系统（automatic mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）和保留指数（retention index，RI）对谷壳中的挥发性成分进行分析，初步建立起谷壳挥发性成分数据库，以期为谷壳的清蒸效果判定提供数据支撑，为实际生产的改进提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷壳：贵州国台酒业集团股份有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）：美国TEDIA公司；正构烷烃（C7～C30）混合对照品溶液：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Gen Pure xCAD Plus纯水机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ME204T电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Agilent DB-WAX UI色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；IT-09A-5磁力搅拌器：上海一恒科学仪器有限公司；顶空固相微萃取手柄和50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头：美国Supelco公司；8890-5977B MSD气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

顶空-固相微萃取法：取谷壳样品10 g放入100 mL顶空瓶中，压紧瓶盖，用装有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头的固相微萃取手柄插入顶空瓶中，对谷壳中的挥发性风味成分进行萃取，以60 ℃水浴恒温萃取50 min，再将萃取头取出及时插入气相色谱-质谱联用仪进样口，连续解吸5min。

1.3.2 顶空固相微萃取条件优化

为获得谷壳挥发性物质顶空固相微萃取的优化条件，在单因素试验结果（最佳样品质量5 g、萃取温度50 ℃、萃取时间60 min）基础上，以挥发性物质的总峰面积为评价指标，以样品质量（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）为影响因素，采用3因素3水平L9（33）正交试验设计对顶空固相微萃取条件进行优化，正交试验因素与水平见表1。

表1 顶空固相微萃取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for headspace solid phase microextraction conditions optimization

1.3.3 保留指数的测定

保留指数（RI）的测定方法参考文献[10]所述。根据气质联用分析条件对C7～C30正构烷烃混合对照品进行GC-MS分析，记录各正构烷烃的保留时间，根据线性程序升温公式计算各待鉴定化合物的RI，其计算公式如下：

式中：x为待分析化合物；TR为保留时间，min；n、n+1为待分析化合物前后两个正构烷烃的碳原子数，且TR（n）＜TR（x）＜TR（n+1）。

1.3.4 气质联用仪器检测条件

气相色谱条件：进样口温度250 ℃；进样方式为分流进样；分流比为5∶1；载气为高纯氦气（He）；流速为1 mL/min；气相色谱升温程序为起始柱温40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至240 ℃，保持20 min，总运行时间75 min。

质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；监测方式为全扫描（full scan，SCAN）；四级杆温度150 ℃；质量数扫描范围35～550 amu，扫描速度1 562 u/s，频率2.9扫描数/s。

定性分析：利用仪器内置未知物分析软件解卷积功能对色谱峰进行处理，首先将化合物的质谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）20标准数据库中的标准图谱进行比对，匹配度＞80%作为初步定性结果。由于RI仅与物质性质、固定相及柱温度有关，能有效避免因质谱图相似而导致定性错误，所以本研究通过测定各化合物的RI值，与文献或数据库报道的保留指数值（retention index of literature，RIL）进行比较，若误差在±3%内，则可对物质定性。最后，通过与标准品进行对比以确定该化合物。

定量分析：采用峰面积归一法，对每个样品的所有挥发性成分进行面积积分，计算出其中每一个组分的百分含量。

1.3.5 数据处理

数据处理利用Minitab 17.0软件对谷壳中挥发性物质测定结果进行分析，采用Origin 2021（9.8）进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 谷壳挥发性物质顶空固相微萃取条件优化正交试验

在单因素试验基础上，选择样品质量（A）、萃取温度（B）和萃取时间（C）3个因素，以挥发性物质的总峰面积为评价指标，采用L9（33）正交试验设计，确定HS-SPME萃取谷壳挥发性物质的最佳参数。每组试验3次平行，正交试验结果与分析见表2。

表2 顶空固相微萃取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for headspace solid phase microextraction conditions optimization

由表2可知，以谷壳中挥发性物质的总峰面积为评价指标，样品质量（A）、萃取温度（B）和萃取时间（C）3个因素对结果影响的主次顺序为C＞B＞A，即萃取时间为最主要的影响因素，其次为萃取温度、样品质量，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中，提取挥发性物质的最佳组合为A3B3C1，即最优顶空固相微萃取条件为样品质量10.0 g，萃取温度60 ℃，萃取时间50 min。

2.2 谷壳中挥发性风味物质GC-MS分析

按照最优HS-SPME条件，对谷壳中挥发性物质进行GC-MS分析，谷壳中挥发性风味物质类别组成见图1。

图1 谷壳中挥发性风味物质组成Fig.1 Composition of volatile flavor substances in rice husk

由图1可知，从谷壳中共鉴定出挥发性物质173种，其中醇类17种，占10.06%，醛类23种，占15.28%，酸类11种，占40.26%，酯类6种，占2.00%，酮类21种，占4.22%，呋喃类7种，占1.34%，呋喃酮类1种，占0.15%，吡嗪类3种，占0.14%，内酯类6种，占1.95%，芳香族44种，占11.44%，烃类21种，占4.43%，杂环类7种，占1.15%，含硫化合物1种，占0.04%，萜烯类5种，占7.54%。其中气味较明显的醇、醛、酸、酯、酮、芳香族及杂环类物质占84.41%，这证明谷壳中异杂味物质较多，在使用前在酒甑中敞盖大汽清蒸30 min的必要性。

2.2.1 醇类物质

谷壳中醇类物质GC-MS分析结果见表3。由表3可知，共定性出17种醇类物质，其中己醇占比最高，为3.36%，其次为正戊醇，占比1.31%。

表3 谷壳中醇类物质GC-MS分析结果Table 3 Results of alcohols in rice husks analysis by GC-MS

异戊醇、正戊醇、己醇、1-辛烯-3-醇、正庚醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇均有在酱香型白酒中检出[11-13]。其中异戊醇、正己醇、1-辛醇是白酒中的主要杂醇油成分，其含量对白酒的风味影响很大，如果其含量过高就会破坏酒体的整体风格，还会引起饮后“上头”等不适的症状，因此，需要控制其含量[14-15]。1-辛烯-3-醇又被称为蘑菇醇，广泛存在于各类食用菌中，在不同香型白酒中也有检测到，其具有强烈的蘑菇味、土腥味和真菌气味，在水中的阈值为2 μg/L，在葡萄酒中的阈值为40 μg/L[16]，在艾纳香油中也被检出，且首次准确定量[17]。

2.2.2 醛类物质

谷壳中醛类物质GC-MS分析结果见表4。由表4可知，谷壳中共检出醛类物质23种，其中饱和醛（9种）包括戊醛、己醛、丙醛二乙基乙缩醛、庚醛、辛醛、壬醛、十一醛、肉豆蔻醛、十五醛。不饱和醛（14种）包括丙烯醛、2-甲基丙烯醛、异戊烯醛、2-己烯醛、（E）-2-庚烯醛、5-乙基环戊-1-烯甲醛、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-癸烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、反-2-十一烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛。其中具有典型青草味的己醛、辛醛占比较高，分别为3.28%、1.09%。

表4 谷壳中醛类物质GC-MS分析结果Table 4 Results of aldehydes in rice husks analysis by GC-MS

丙烯醛是一种具有恶臭、刺激性气味的物质，被国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）确认为第Ⅲ类致癌物，朱梦旭[19]研究表明，在浓香型、酱香型、清香型等白酒中都检测到丙烯醛的存在，考虑到综合摄入，有必要降低白酒中丙烯醛的含量并制定限量标准。戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛主要呈脂肪臭、花香、水果香、醛香，其在46%vol酒精水溶液中的嗅觉阈值分别为725.41μg/L、25.48μg/L、409.76μg/L、39.64μg/L、122.45μg/L[20]，其中丙醛二乙基乙缩醛、十一醛、肉豆蔻醛、十五醛也是首次在谷壳中被检出。（E）-2-辛烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛呈青草和油脂的复合香气，阈值仅为0.09 μg/L，是米饭中的主要香气成分[21]。5-乙基环戊-1-烯甲醛、（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、反-2-十一烯醛也是首次在谷壳中被检测到。由此可见，谷壳中含有大量的呈青草味、油脂味、花香味等复杂气味的醛类物质，因此谷壳清蒸工艺将直接影响清蒸后谷壳的香气特征。

2.2.3 酸类物质

谷壳中酸类物质GC-MS分析结果见表5。由表5可知，谷壳中共检出酸类物质11种，其中含量最高为顺式-13-十八碳烯酸，占比为14.86%，其次为肉豆蔻酸、棕榈油酸，占比分别为6.60%、6.26%。

表5 谷壳中酸类物质GC-MS分析结果Table 5 Results of acids in rice husks analysis by GC-MS

脂肪酸对于白酒的风味具有重要作用，辛酸、壬酸、癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸等脂肪酸也广泛存在于果酒中。脂肪酸类物质在酒精水溶液中主要呈酸臭、窖泥臭、汗臭，其中辛酸、壬酸、癸酸、十二酸的阈值分别为2 701.23 μg/L、3 559.23 μg/L、13 736.77 μg/L、9 153.79 μg/L[20]。十二酸、十五酸之前已在谷壳中检出[23]，其他脂肪酸首次在谷壳中鉴定出。

2.2.4 酯类物质

谷壳中酯类物质GC-MS分析结果见表6。由表6可知，谷壳中共检出酯类物质6种，具有醚味、水果香的乙酸乙烯酯占比最高，为0.80%，其次亚油酸乙酯和棕榈酸乙酯的占比也较高，分别为0.54%和0.30%。

表6 谷壳中酯类物质GC-MS分析结果Table 6 Results of esters in rice husks analysis by GC-MS

酯类物质呈现水果香和甜香，其中正己酸乙烯酯也是猪肉中的酯类物质，棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯主要呈现蜡味，也是白酒中重要的风味物质，含量过高还会造成酒体的浑浊，因此要严格控制其含量[25]。

2.2.5 酮类物质

谷壳中酮类物质GC-MS分析结果见表7。由表7可知，谷壳中共检出21种酮类物质，其中丙酮是主要的酮类物质，占比为1.01%。

表7 谷壳中酮类物质GC-MS分析结果Table 7 Results of ketones in rice husks analysis by GC-MS

丙酮、2,3-戊二酮、2-庚酮、乙偶姻、6-甲基-5-庚烯-2-酮在白酒中检出，乙偶姻可以由枯草芽孢杆菌产生，与氨反应生成具有扩张血管和改善血液微循环的四甲基吡嗪[26]。4-己烯-3-酮是国家允许使用的食品用香料。3-辛烯-2-酮呈土腥味、奶油味，是米饭中的香气化合物，6-甲基-2-庚酮呈香樟味，羟基丙酮具有刺激性的香气，3-甲基-2-环戊烯-1-酮具有焦糖香味，6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮具有青草香，辛辣味。与前期研究相比[21]，本研究鉴定出的酮类物质差异性较大，这也证明谷壳中挥发性物质组成的复杂性，值得后面进一步深入探讨。

2.2.6 呋喃及呋喃酮类物质

谷壳中呋喃及呋喃酮类物质GC-MS分析结果见表8。由表8可知，谷壳中共检出7种呋喃类物质及1种呋喃酮类物质，2-戊基呋喃占比最高，为1.16%。

表8 谷壳中呋喃及呋喃酮类物质GC-MS分析结果Table 8 Results of furans and furanones in rice husks analysis by GC-MS

3-甲基呋喃具有类似乙醚的气味，2-正丁基呋喃具有果香、酒香、甜香，在酱香型习酒中2-正丁基呋喃具有较高的香气强度值[24]。在对酱香型缺陷白酒中风味化合物的研究表明，2-正丁基呋喃的气味活度值（ordor activity value，OAV）＞2 000，呈现在盐菜味酒中最高，但整体差异不明显[27]。2-戊基呋喃是水蜜桃的香气化合物，呈现花香、清香[26]。谷壳中含有多缩戊糖，在低pH下或受热后会生成糠醛，其含量在酱香型白酒中含量最高，使酒产生燥辣味、糠味，糠醛具有苦杏仁气味，也是引起白酒苦味的主要物质[21，28-29]。

2.2.7 吡嗪及内酯类物质

谷壳中吡嗪及内酯类物质GC-MS分析结果见表9。由表9可知，谷壳中共检出3种吡嗪类物质和6种内酯类物质。

表9 谷壳中吡嗪及内酯类物质GC-MS分析结果Table 9 Results of pyrazines and lactones compounds in rice husks analysis by GC-MS

四甲基吡嗪在酱香型白酒中含量最高，有类似于爆米花、坚果和水果的特别香味，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用[30]。内酯类物质是许多食品风味的关键气味物质之一，在白酒中已经检测到γ-己内酯、γ-壬内酯，γ-壬内酯的阈值较低，仅为9.70～30.00 μg/kg，其占比分别为0.22%、0.51%。二氢猕猴桃内酯广泛存在于多种茶中[31]，占比为0.46%。因此，谷壳也可能是白酒中四甲基吡嗪及内酯类物质的来源之一。

2.2.8 芳香族类物质

谷壳中芳香族类物质GC-MS分析结果见表10。由表10可知，谷壳中共检出44种芳香族类物质。其中苯乙醛和4-乙烯基苯酚占比较大，分别为2.91%和2.00%。

表10 谷壳中芳香族类物质GC-MS分析结果Table 10 Results of aromatic compounds in rice husks analysis by GC-MS

苯甲醛、苯乙醛、萘、2-甲氧基苯酚（愈创木酚）、苯甲醇、苯乙醇、萘、2-甲基萘、苯并噻唑、苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-乙烯基愈疮木酚）等都是白酒中具有典型气味的化合物[7]。苯甲醛、苯乙醛、2-羟基苯甲醛、苯乙醇、喹啉、苯并噻唑、苯酚、异丁香酚等物质均是国家允许使用的食品添加剂。酚类物质在酱香型白酒风味和口感上也起着非常重要的作用，相关研究表明，4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈创木酚是引起白酒产生糠味的物质[32-33]。同时，谷壳中也检测到了邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯等塑化剂成分，如果谷壳清蒸不完全，可能会随着蒸馏迁移到白酒中造成对人体的伤害[34]。由此可见，谷壳中的芳香族物质组成复杂，也证明谷壳在使用前清蒸的重要性。

2.2.9 烃类及杂环类物质

谷壳中烃类及杂环类物质GC-MS分析结果见表11。由表11可知，谷壳中共检出21种烃类物质及7种杂环类物质。

表11 谷壳中烃类及杂环类物质GC-MS分析结果Table 11 Results of hydrocarbons and heterocyclic compounds in rice husks analysis by GC-MS

1,1-二氯乙烯、（E）-1,2-二氯乙烯、丙烯腈具有不愉快的刺激性气味。癸烷、十二烷、二十五烷被证明是玫瑰、兰花及陈皮和青皮挥发油的主要成分[26]。杂环类含氮化合物吡啶、2-甲基吡啶、异噻唑具有臭味，其中吡啶在酱香型白酒的基酒及轮次酒中都有检出[28]。4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮具有甜香，花香。

2.2.10 含硫及萜烯类物质

谷壳中含硫及萜烯类物质GC-MS分析结果见表12。由表12可知，谷壳中共检出1种含硫物质及5种萜烯物质。其中植醇的占比最高，为1.33%。

表12 谷壳中含硫及萜烯类物质GC-MS分析结果Table 12 Results of sulfur-containing and terpene compounds in rice husks analysis by GC-MS

含硫化合物二甲基亚砜带有苦味，在酸存在时加热会产生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫、甲磺酸等化合物。萜烯类物质中茶香酮、香叶基丙酮、反式-β-紫罗兰酮也是国家标准允许使用的食品添加剂，分别具有茶香酮具有木香和茶叶香气、木兰香气、花香。

3 结论

本研究建立了顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用结合自动质谱解卷积系统和保留指数对谷壳中的化学成分进行鉴定分析比较的方法，利用正交试验优化了HS-SPME萃取参数。结果表明，HS-SPME的最优条件为样品质量为10.0 g，萃取温度为60 ℃，萃取时间50 min。GC-MS分析结果表明，谷壳中共鉴定出挥发性物质173种，其中醇类17种，占10.06%，醛类23种，占15.28%，酸类11种，占40.26%，酯类6种，占2.00%，酮类21种，占4.22%，呋喃类7种，占1.34%，呋喃酮类1种，占0.15%，吡嗪类3种，占0.14%，内酯类6种，占1.95%，芳香族44种，占11.44%，烃类21种，占4.43%，杂环类7种，占1.15%，含硫化合物1种，占0.04%，萜烯类5种，占7.54%。其中气味较明显的醇、醛、酸、酯、酮、芳香族及杂环类物质占到了84.41%，这也证明谷壳中影响基酒质量的异杂味物质较多，因此在使用前需进行大汽清蒸。本研究方法准确度高，有利于企业全面认识谷壳中的挥发性成分，为后续深入研究谷壳清蒸工艺和清蒸标准提供数据支撑，为实际生产提供理论指导，有效防止白酒生产过程中异杂味物质的迁移，提高白酒的质量。