银-铜双金属纳米粒子/聚乳酸复合纳米纤维膜的制备及其抗菌性能

戎成宝, 孙 辉, 于 斌

(1.浙江理工大学 纺织科学与工程学院(国际丝绸学院), 浙江 杭州 310018;2.浙江省现代纺织技术创新中心, 浙江 绍兴 312000)

在过去的几十年里,全世界范围内细菌抗生素耐药性的增加已经对公共健康构成了严重威胁。不良的杀菌、抗菌方法可能会增加与伤口感染有关的风险[1]。抗菌纺织品对细菌的侵入有阻隔作用,且能够抑制细菌的生长和繁殖,因此,开发绿色、安全和耐用的抗菌纺织品,以保护伤口不受耐药性细菌的影响十分必要。

抗菌纳米纤维膜因其比表面积高[2]、纳米多孔、价低、制备方法简单等特点,已成为研究人员关注的焦点[3-6]。用于抗菌敷料的静电纺丝纤维膜不仅能保护伤口免受感染,同时也应对人体无毒、对环境友好[7]。聚乳酸(PLA)由于其独特的生物降解性和生物相容性,已被广泛应用于生物医学、皮肤组织工程和食品包装等行业[8-9]。但PLA自身不具有抗菌性,在抗菌材料的应用方面受到了限制,通常需对PLA进行抗菌改性来解决这一问题。

纳米合金由于其较高的比表面积和表面活性,对细菌的黏附、生长和扩散具有强大的抑制能力,即使在较低的浓度下也显示出明显的抗菌特性[10]。近年来,银-铜双金属纳米粒子由于原子间的灵活配置,可形成多种微观结构,且加入的元素之间具有突出的协同效应,在抗菌方面取得了新的进展与应用[11-12]。Nowak等[13]研究表明,银-铜双金属体系的抑菌性能相对于单金属银、铜得到了很大的提高。Benjamín等[14]发现银-铜双金属纳米颗粒(Ag-Cu NPs)通过细胞膜错位破坏细菌的生长能力,导致细菌渗漏和细胞死亡,并系统阐述了Ag-Cu NPs在广谱抗菌机制中的构效关系。与单一金属体系相比,Ag-Cu NPs的活性范围更广,活性更强,对更多的细菌菌株有效[15-16],是一种很有前景的抗菌剂。

本文通过简单绿色的方法合成了粒径约为32 nm的Ag-Cu NPs,并通过调整Ag-Cu NPs与PLA的共混比例制备了不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜。研究了纤维膜的形貌、组成结构和亲水性等,测试分析了其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性,以期为具有抗菌性能的PLA复合纳米纤维膜在医疗卫生领域的应用提供参考。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

材料:硝酸铜三水合物(Cu(NO3)2·3H2O,上海易恩化学技术有限公司);硝酸银(AgNO3,常州市国宇环保科技有限公司);二氯甲烷、L-抗坏血酸(上海麦克林生化科技有限公司);氢氧化钠(NaOH,天津市永大化学试剂有限公司);PLA(相对分子质量为160 000,美国 Nature Works 公司);丙酮(杭州双林化工试剂有限公司);氯化钠(杭州高晶精细化工有限公司);营养琼脂、酵母浸粉、蛋白胨(杭州百思生物技术有限公司);金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(北京保藏生物科技有限公司)。

仪器:Ultra55 型热场发射扫描电子显微镜、Zeiss Ultra 55元素面能谱仪(德国Carl Zeiss AG公司);D8 Discover 型高分辨X 射线衍射仪(德国Bruker AXS公司);Nicolet5700 型傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);DZF-6050型真空箱(上海精宏试验设备有限公司);JY-82B接触角测试仪(承德鼎盛仪器有限公司)。

1.2 试样的制备

1.2.1 Ag-Cu NPs的制备

采用化学还原法制备Ag-Cu NPs。首先用去离子水制备以下溶液:硝酸银(0.01 mol/L)、硝酸铜(0.01 mol/L)和抗坏血酸(0.01 mol/L)。实验在60 ℃水浴锅中进行,将200 mL抗坏血酸溶液用NaOH溶液调节pH值到碱性,然后将100 mL硝酸银溶液和100 mL硝酸铜溶液均匀混合,在连续的机械搅拌下逐滴滴入至抗坏血酸溶液中。当反应完成后,将得到的悬浮液在10 000 r/min下离心15 min得到黑色粉末。用丙酮溶液洗涤粉末并进行离心分离(10 000 r/min,30 min),重复5次以除去多余的杂质,得到Ag-Cu NPs,最后将其在真空烘箱中干燥,并避光储存。整个制备过程速度快、成本低、无有机溶剂且不产生有毒废料,制备方法绿色环保。

1.2.2 Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的制备

采用相分离法通过静电纺丝技术制备了不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜,具体制备流程图如图 1 所示。

首先,将一定质量的PLA溶解在二氯甲烷与丙酮(二者质量比为4∶1)的混合溶剂中,制备质量分数为15%的PLA纺丝液。然后分别将相对于PLA质量1%、3%、5% 和7% 的Ag-Cu NPs加入到PLA纺丝液中(具体质量配比如表 1 所示),在室温下超声波搅拌2 h,最后将所得静电纺丝溶液装入10 mL一次性注射器中进行静电纺丝,得到不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜。纺丝速度为3 mL/h,电压为15 kV,针尖到收集器距离为15 cm,温度为25 ℃,收集器转速为100 r/min。将所制备的纳米纤维膜通风干燥24 h,以去除残留的溶剂。

表1 复合纳米纤维膜组成配比表Tab.1 Compositions of electrostatic spinning membranes

图1 Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的制备路线图Fig.1 Preparation route scheme of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

1.3 测试与表征

1.3.1 表面形貌观察及纤维直径测试

采用扫描电子显微镜观察Ag-Cu NPs和复合纳米纤维膜的表面形貌。工作电压为 3 kV,工作距离为8.5 mm。用 Image J 软件分别对电镜照片中的100 个颗粒和100 根纤维进行平均值和标准方差计算。

1.3.2 表面元素分布测试

采用高分辨X射线能谱分析仪对复合纳米纤维膜的表面元素进行分析,采用元素面能谱仪观察单根纤维中Ag-Cu NPs的分布情况。

1.3.3 结晶结构测试

采用X 射线衍射仪测试样品的结晶结构,扫描范围为 30° ～ 80°,扫描速度为 5 (°) /min。用 MDI Jade 6 软件对XRD图谱进行分峰拟合后,分析复合纳米纤维膜的结晶特性。

1.3.4 化学结构测试

采用傅里叶红外光谱仪测试复合纳米纤维膜的化学结构,扫描范围为4 000～500 cm-1,分辨率为2 cm-1。

1.3.5 水接触角测试

将复合纳米纤维膜裁成 1 ×1 cm后,贴在载玻片上,用视频接触角测定仪测量样品的水接触角,将单滴2 μL水滴至样品表面,等待3 s直至平衡,测量多次取平均值。

1.3.6 抗菌性能测试

参照GB/T 20944.3—2008《纺织品 抗菌性能的评价 第3部分:振荡法》,测试不同样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能,测试时间为18 h。以纯PLA 纳米纤维膜为对照样,1%Ag-Cu NPs/PLA、3%Ag-Cu NPs/PLA、5%Ag-Cu NPs/PLA和7%Ag-Cu NPs/PLA为测试样,每份样品称取(0.75±0.05)g,根据下式计算活菌浓度和测试样的抑菌率,每个样品分别测试3次取平均值。

式中:Y为抑菌率,%;Wt为对照样的菌落平均数;Qt为测试样品的菌落平均数。

2 结果与讨论

2.1 表面形貌分析

图 2 为Ag-Cu NPs和Ag-Cu NPs/PLA的扫描电镜照片。从图 2(a)可以看出,Ag-Cu NPs呈现不规则球形形态。通过高分辨率图像分析得到Ag-Cu NPs的平均直径为(32.22±5.75)nm。从图2(b)可看出,PLA纳米纤维的直径均匀,表面粗糙,具有多孔结构,多孔纳米纤维的形成取决于2个重要因素:静电纺的挥发性溶剂和环境湿度[17],当溶剂挥发且环境湿度较高时,水蒸气在纳米纤维表面凝结并形成水滴,随着蒸发冷却和纤维表面水的渗透,从而制备出多孔PLA纳米纤维[18]。从图2(c)～(f)可以看出,加入Ag-Cu NPs后,复合纳米纤维表面粗糙,未观察到颗粒存在,这可能是因为在静电纺丝过程中,Ag-Cu NPs被包裹分散在PLA基体内。此外,纤维表面仍有大量的小孔,但小孔的数量相对于纯PLA纳米纤维较少,小孔直径相对于纯PLA纳米纤维略大,这是因为Ag-Cu NPs的加入导致纺丝液导电率增大,在静电纺丝时射流携带的电荷量增加,从而增强了射流的不稳定性,溶剂难以完全挥发,影响了孔结构和纤维的形成,可纺性变差[19]。

图2 Ag-Cu NPs、PLA与不同组成的Ag-Cu NPs/PLA的扫描电镜照片Fig.2 SEM images of Ag-Cu NPs,PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

图3 PLA及不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜纤维的平均直径Fig.3 Average diameters of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

图4 Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜单根纤维的元素分布图Fig.4 Element mapping of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes for single fiber

2.2 纤维直径分析

图 3 为纳米纤维膜的纤维直径分布图。可以看出,Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜中纤维平均直径均小于纯PLA纳米纤维的平均直径,这是因为Ag-Cu NPs的加入导致喷出的射流表面积累了更高的电荷密度,静电纺丝射流携带的整体电荷明显增加[20],在电场作用下射流可以克服自反力获得更高的伸长力,因此,随着电荷密度的增加,纤维的直径大大减小,且分布变得更窄[21]。但随着Ag-Cu NPs质量分数的增加,Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜纤维平均直径又不断增加,这是因为随着Ag-Cu NPs占比的增加,纺丝液浓度、黏度增大,从而导致了纤维直径的明显增加。

2.3 元素分析

复合纳米纤维膜中各元素的含量如表 2 所示。结果表明,纯PLA纳米纤维膜表面仅含有碳和氧元素,加入Ag-Cu NPs后,复合纳米纤维膜表面出现银和铜元素,说明Ag-Cu NPs被包裹在PLA基体中。单根纤维中银、铜元素区域分布如图 4所示。可以看出,银、铜元素沿着纤维径向排列,说明Ag-Cu NPs与PLA共混喷丝时,Ag-Cu NPs沿着纤维拉伸方向均匀分布。

表2 静电纺丝纤维膜表面元素含量Tab.2 Surface element contents of electrospun fiber membranes

2.4 结晶结构分析

图5为PLA及不同组成的Ag-Cu NPs /PLA复合纳米纤维膜的X射线衍射图。纯PLA纳米纤维膜在2θ为10° ～ 20°之间出现1个广泛的衍射峰,表明其无定形的性质。对于不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜,其XRD曲线在2θ为 42.7°、50.2°和73.9° 处出现了与金属Cu相关的不同衍射峰,分别对应Cu的(111)、(200)、(220)晶面;而在2θ为 38.4°、44.4°、64.8°和77.1° 处出现了归因于Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面的衍射峰[22]。除此之外,在2θ为 36.7°和61.6° 处还出现了归属于Cu2O的衍射峰,这是因为在纺丝过程中,聚合物溶液喷射成丝时溶剂挥发使空气中的氧气与Ag-Cu NPs接触,导致铜发生部分氧化所致。上述结果也表明,Ag-Cu NPs已混入复合纳米静电纺丝纤维膜中,这与2.3节中分析的结果一致。

图5 PLA及不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的XRD图谱Fig.5 XRD patterns of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

2.5 化学结构分析

图6为PLA与不同组成的Ag-Cu NPs /PLA复合纳米纤维膜的红外光谱图。Ag-Cu NPs与PLA的相互作用和相行为可以通过红外光谱分析确定[23]。

图6 PLA及不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的红外光谱图Fig.6 FT-IR spectra of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLAcomposite nanofiber membranes

图7 PLA与不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的水接触角Fig.7 Water contact angles of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

2.6 水接触角分析

图 7示出PLA及不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的水接触角。可以看出,纯PLA膜的水接触角约为135°,显示出固有的较差的亲水性;加入Ag-Cu NPs后,Ag-Cu NPs/PLA的水接触角略有下降,这是因为加入的Ag-Cu NPs具有一定的亲水性。

2.7 抗菌性能分析

表 3 示出对照组、PLA及Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率。可以看出,纯PLA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力弱。对于Ag-Cu NPs/PLA来说,其抑菌率均大于96%,这主要是因为银铜双金属纳米粒子的引入,使银、铜离子的释放达到杀菌性能。研究表明:在复合材料中存在铜和银纳米粒子的协同作用,从而使材料对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出良好的抑菌活性[28-29],无论银铜比例如何,对革兰氏阴性菌、阳性菌和白色念珠菌均表现出较强的抑菌效果[30],这种增强的抗菌效果可能与银铜合金形成过程中银离子的释放直接相关[31]。随着Ag-Cu NPs含量的增加,复合纳米纤维膜的抑菌率不断增加,这是因为NPs的抑菌活性与其浓度呈显著正相关[32]。当添加Ag-Cu NPs为 7% 时,Ag-Cu NPs/PLA显示出很高的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均分别高达 99.29% 和 99.35%,且Ag-Cu NPs/PLA对大肠杆菌的抗菌效果都优于金黄色葡萄球菌,这是因为金黄色葡萄球菌的细胞壁比大肠杆菌厚,所以细胞壁较薄且蛋白质含量较高的大肠杆菌更易受到离子攻击。

表3 PLA与不同组成的Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的抑菌率Tab.3 Antibacterial efficiencies of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

3 结 论

1)以银和铜的硝酸盐溶液为原料,抗坏血酸为还原剂,采用化学还原法合成了银-铜双金属纳米粒子(Ag-Cu NPs),然后利用静电纺丝技术制备了Ag-Cu NPs/聚乳酸(PLA)复合纳米纤维膜。通过观察发现,复合纳米纤维膜表面多孔、粗糙,Ag-Cu NPs包覆在PLA纳米纤维内且均匀地沿着纤维拉伸方向排列。相较于纯PLA纤维膜,Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜的纤维直径下降。

2) Ag-Cu NPs与PLA之间仅发生物理作用,未产生明显的化学作用;相较于纯PLA纳米纤维膜,Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜水接触角略有下降。

3)Ag-Cu NPs/PLA复合纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌性,当Ag-Cu NPs为7%时,Ag-Cu NPs/PLA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率超过99%,实现了对其的高效抗菌作用。