甲真菌病的真菌学检测方法研究进展

曹冰莹, 廖德君,2, 杨茜, 杨政敏

1.黔南民族医学高等专科学校,2.黔南州人体寄生虫病研究重点实验室,贵州 都匀 558000

甲真菌病(onychomycosis)是最常见的指(趾)甲疾病,由皮肤癣菌、酵母菌和非皮肤癣菌性霉菌侵犯甲板和(或)甲床所致[1],以甲颜色改变、甲下角化过度、甲肥厚和甲分离为主要临床特征[2]。该病呈全球分布,在世界范围内的患病率为5.5%,占临床上所有指甲疾病的50%[3],被认为是全球分布的主要公共卫生问题之一。目前临床上甲真菌病的真菌学诊断仍以传统的真菌培养、直接镜检、组织病理检查为主[1],这些方法灵敏度较低,耗时长,不能鉴定真菌种类,不利于甲真菌病的早期诊断和分类治疗。近年来,精确到属、种的真菌学检查方法层出不穷,已成为真菌分类学研究的热点。本文现对甲真菌病的真菌学检测方法的研究进展进行综述。

1 传统检测方法

以直接镜检、真菌培养和组织病理检查为主的传统诊断技术被广泛地应用于临床诊断工作中,仍是甲真菌病真菌学诊断的主要手段。

1.1 直接镜检

1.1.1 KOH溶甲镜检法 该方法是利用10%～20%氢氧化钾(KOH)溶液溶解标本病甲后,借助显微镜进行形态学诊断。该方法简便,费用低,可在1 h内出具诊断结果,因此被广泛地应用在临床中[4-9]。然而该方法的诊断容易受病甲标本采集质量和检验技术水平的影响,并且仅能确定真菌是否存在而不能明确真菌的种类。

1.1.2 荧光染色镜检法 该方法是使用真菌荧光染色剂浸染病甲碎片标本后,在荧光显微镜下进行观察诊断。该方法可增强显示病甲中的真菌结构,更易被检查者观察发现,因此其灵敏度与KOH溶甲镜检法相比显著提升[10-11]。该法具有简便、无创、检出率高等优点,但也不能确定病原真菌的种类。

1.2 真菌培养

1.2.1 普通培养 真菌培养是指使用沙氏培养基、马铃薯培养基等不同培养基在25～30 ℃下对病甲进行培养2至4周,通过肉眼观察菌落特征和(或)使用显微镜观察真菌的孢子、菌丝等形态学特征来诊断,可以鉴别病原真菌的种类以及判断其活力[9, 12-14]。该法特异性强,灵敏度较高,可以提供有关真菌活性信息、鉴定真菌种类以及真菌药敏情况,有助于临床诊疗工作。真菌培养是一项操作相对复杂、耗时、成本较高的诊断方法,其可靠性很大程度上取决于检测中心的专业性。此外,真菌培养容易受霉菌的污染,对霉菌所致的甲真菌病常需要重复培养3次方可确定。

1.2.2 显色培养及生化反应 两者主要可用于酵母菌的鉴定。显色培养是通过菌落颜色来鉴定菌种,该法能鉴定出超过90%的致病性酵母菌,如白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌等[15]。鉴定酵母菌种属的生化反应试验一般包括尿素酶、海藻糖、酚氧化酶、糖同化、糖发酵、硝酸盐试验。目前,临床上已有基于生化反应的酵母菌自动化鉴定系统,可以将临床常见的酵母样真菌鉴定到种水平,对酵母菌的鉴定能力明显优于显色培养,且与新兴的分子鉴定技术有很好的一致性[16]。

1.3 甲组织病理学检查

甲组织病理学检查使用组织染色对甲标本进行染色后观察,可以获得真菌感染的直接证据。该技术可使用过碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain,PAS)或六胺银染色(grocott methenamine silver stain,GMS)对真菌菌体进行染色,以增加显微镜检查时的能见度[17-19]。实施甲组织病理学检查需要大量的实验室准备,如甲组织固定、脱水、包埋、切片等。虽然组织病理学是传统甲真菌病诊断方法中最敏感的,但它并不能鉴定致病真菌种类,且存在操作复杂、耗时较长、标本需要量多、实施条件高等问题,导致其在临床诊断工作中逐步被其他诊断技术所替代。

2 新兴检测技术

2.1 免疫学检测技术

由于致病真菌仅在被侵犯的甲板内生长繁殖,人体免疫系统难以产生有效的免疫应答,因此认为真菌特异性抗体检测不是甲真菌病病原检查的最好方案,而真菌特异性抗原检测是诊断甲板真菌感染的可行方案,其能快速提供检测结果,在甲真菌病病原诊断和流行病学调查等领域具有重要价值。

2.1.1 免疫层析法(immunochromatography,ICA) 该法是一种利用特异性抗体检测病甲中真菌抗原的免疫学诊断方法,如胶体金法、侧流免疫层析法(lateral flow immunochromatographic assay,LFIA)等。日本学者利用胶体金技术开发了一种可检测绝大部分甲真菌病病原真菌的体外诊断试剂盒,其灵敏度高达98.0%,而特异度为88.2%[20]。Tsuboi等[21]应用侧流免疫层析法对甲真菌病患者进行红色毛癣菌特异性抗原检测,结果显示,在不能检测其他真菌的情况下,该方法灵敏度和特异度分别为84.8%和83.9%。该法用目视即可完成检测结果的判断,对检测人员和检测设备的要求不高,可用于疾病初筛和流行病学调查,但由于缺少大数据的方法学研究,因此尚未取得临床的认可。

2.1.2 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 酶联免疫吸附测定指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。Méhul等[22]用重组的红色毛癣菌和趾间毛癣菌的类枯草杆菌蛋白酶6(subtilisin-like protease 6,Sub6)作为抗原分别制备了Sub6的兔抗血清和小鼠单克隆抗体,并应用ELISA(双抗体夹心法)对患者进行了检测,显示出该方法具有较高的灵敏度和特异度。

2.2 基于PCR的分子生物学鉴定技术

生物学鉴定技术主要有常规聚合酶链式反应(PCR),荧光实时定量PCR(RT-PCR),巢式PCR(nest-PCR),多重 PCR(mutiplex -PCR),限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)等,具有敏感性高、检测快、不受检测人员形态学鉴定水平的限制等优点,有广阔的应用前景。

2.2.1 PCR 是一种利用特异性引物扩增DNA片段来鉴定真菌的分子生物学技术,即用真菌特异的分子引物来扩增测试样品中的真菌DNA,以鉴定真菌生物亚型,具有较高的敏感度和特异度[23-24]。该法在镜检阳性但真菌培养阴性的疑似患者标本的检测中显示出巨大的优势,但在应用该法时需要考虑成本、假阳性、假阴性以及污染的可能。

2.2.2 RT-PCR 是一种使用不同的特异性引物,结合探针作为染料,直接从临床样本中检测出一种或多种皮肤癣菌的分子方法。应用RT-PCR法可显著提高甲真菌病致病菌的检出率,可将真菌鉴定精确至属种水平[24-27]。该方法在其他病原生物的诊断上已经取得临床工作者的认可,是一种很有应用前景的诊断技术。

2.2.3 nest-PCR 巢式PCR技术由初级和次级扩增组成,初级扩增的产物用作次级扩增的模板,以提高特异度和灵敏度[28-29]。杨静等[30]基于28 S rRNA基因序列的巢式PCR方法快速检测甲真菌病真菌种类,巢式PCR敏感性为93.33% (168/180),特异性为100% (168/168)。巢式PCR因涉及两次扩增步骤,污染风险更高。

2.2.4 PCR-RFLP 是一种扩增含有小规模遗传变异核酸的特定片段,然后用适当的限制性内切酶处理,根据片段的电泳结果进行鉴定的技术。目前,PCR-RFLP已经能够直接从指甲、皮肤或头发样本中成功检测到红色毛癣菌和须癣毛癣菌[31-32]。PCR-RFLP简便、经济、不依赖先进的仪器设备,但是需要限制性内切酶、操作复杂以及耗时费力的缺点限制了其在临床上的应用。

2.2.5 PCR-酶联免疫吸附试验(polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay,PCR-ELISA) 是一种应用ELISA方法检测PCR产物的定量试验。这一技术相对于传统的凝胶光密度定量,在灵敏度、特异度、准确度上有很大的提升,可满足临床诊断甲真菌感染的要求,并且只要有扩增仪和酶标仪就可以进行。但有研究发现,PCR-ELISA应用于甲真菌病的致病菌诊断及鉴定时,其检出率并未体现出巨大的优势[33]。Savin等[34]对法国生产的一种甲真菌病PCR-ELISA诊断试剂进行评估,结果发现在经真菌学证实的患者标本中仅有86.3%的检出率,且未能鉴定至属、种水平。因此,该法仍需在检出效能和种属鉴定上继续探索。

2.3 基因芯片技术(gene chip)

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析,包括寡核苷酸微阵列(Oligo-microarray)及DNA微阵列(DNA microarray)。目前该技术已被广泛应用到各种病原生物的检测中,具有高通量、速度快、灵敏度和特异度高等优点。Han 等[35]基于真菌rRNA ITS序列设计了一组DNA微阵列,以真菌培养为金标准,其阳性预测值和阴性预测值显著高于真菌培养法,且检测时间不超过24 h。基因芯片技术仅需要18 h就可以1次检测50多种不同的微生物,灵敏度明显高于直接镜检法和培养法[36]。基因芯片技术可同时检测多个基因表达谱,在分子诊断和研究上有巨大潜力,但技术复杂,操作难度高,单次检测成本较高,还存在误差和可重复性差的局限,故该技术需在成本与质量控制上进一步探索。

2.4 恒温核酸扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术,不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测,检测成本远低于荧光定量PCR,具有简单、快速、特异性强的特点,目前已成功地应用于分子生物学领域。已有学者成功应用LAMP技术鉴定出甲真菌病患者的病原真菌,并显示出极高的灵敏度和特异度[37],但该技术仍处于初级阶段,还存在非特异性扩增产物不易鉴别等问题,故目前应用LAMP技术鉴别病原真菌的研究较少,其未来发展潜力巨大。

2.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF MS 是一种基于蛋白质组学的研究技术,能够直接测定蛋白质、多肽、核酸、寡糖等生物大分子。临床标本经分离和纯培养后,可通过质谱技术获得可疑菌落病原体的蛋白质谱峰图,将其与数据库中参考光谱的特征峰进行对比,即可得到鉴定结果,匹配度越高,结果越可信。目前,已有学者成功应用这项技术对甲真菌病病原真菌进行了种属鉴定,显示出较高的灵敏度和特异度[38-39]。但此方法受限于真菌的分离与培养,因此并不能用于培养阴性的标本检测。此外,质谱检测技术还受图谱库的丰度、提取方法等因素的影响。

2.6 光谱学鉴定

2.6.1 红外光谱分析 红外吸收光谱是利用物质对不同频率红外光的吸收特性,获得分子内化学键、官能团的振动和转动信息进行物质分析鉴定的方法。随着傅里叶变换红外光谱学技术(frourier transform infrared spectroscopy,FTIR)的出现和衰减全反射技术(attenuated total refraction,ATR)的应用,红外光谱分析技术逐步开始在微生物检测领域广泛应用。De Bruyne 等[40]利用ATR-FTIR谱技术成功用于探测、鉴定甲真菌病体外模型和活体甲标本中的致病菌至属或种的水平。与目前其他致病真菌检测方法相比,红外光谱技术具有适用范围广、判断准确、快捷、费用低的特点,具有广阔的临床应用前景,但仍需解决真菌培养方法及预处理过程的标准化、设备成本的优化、致病真菌红外光谱参考数据库的建立和分析方法的程序化等问题。

2.6.2 拉曼光谱分析 拉曼光谱分析法是基于拉曼散射光谱,对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息,并应用于分子结构研究的一种分析方法。利用已构建的生物大分子拉曼光谱数据库[41],学者们运用拉曼光谱分析可以准确地鉴定出皮肤癣菌、酵母菌和霉菌,并且可以达到属、种甚至菌株水平[42-44]。Smijs 等[45]应用拉曼光谱分析技术对厚为50 μm的人离体甲感染模型进行分析,准确鉴定出红色毛癣菌、白念珠菌、短帚霉等常见的甲真菌病病原体。该方法用于致病真菌的检测时具有很多优势:标本需要量少,灵敏度高,可达单个孢子水平;能直接使用固体培养基上的菌落,无需样本标记或染色等预处理,耗材少;操作简便,测定时间短等。但此方法也存在试验条件与设备要求高,数据库缺乏和数据分析繁琐,部分相似的菌种难以区分等问题。

3 传统检测方法与新兴检测技术的比较

以直接镜检、真菌培养和病理组织检查为主的传统诊断技术被广泛地应用于临床诊断工作中,仍是甲真菌病真菌学诊断的主要手段。然而传统技术在真菌种属的鉴定上存在明显的局限,主要体现为严重依赖检测人员的技术水平和检测周期过长。免疫学诊断、分子生物学诊断、MALDI-TOF MS 和光谱学诊断等新兴技术在很大程度上摆脱了对检测人员技术水平的依赖,通常都具有快速简便、准确的优点,但也明显存在检测成本高、操作流程和技术尚未标准化、检测结果存在一定的假阴性与假阳性等局限,因此尚未获得临床工作者的认可。传统检测方法与新兴检测技术的优劣详见表1。

表1 甲真菌病真菌学传统检测技术与新兴检测技术的比较Table 1 Comparison of traditional and emerging mycological detection technologies for onychomycosis

4 结语与展望

快速准确的真菌学诊断是治愈甲真菌病和防治复发的关键因素,而目前针对甲真菌病的传统检测方法与新兴检测技术各有优缺点。开发真菌学检测方法成为甲真菌病诊治领域的研究热门。随着科技的进步,基于深度学习技术与人工智能技术在医学诊断领域取得了重大进展,相信不管是基于形态学的真菌学传统诊断技术,还是与医学免疫学、分子生物学、医学物理学紧密相关的新兴诊断技术,亦或是甲真菌病临床诊断技术,也将迎来广阔的发展前景。