基于纤维素纳米晶乳化陈皮精油的淀粉基抗菌膜的制备与性能

陈启杰，张 朋，游 娜，张亚增，栾鹏程，王正敏，罗永清

（1.长沙理工大学化学化工学院，湖南 长沙 410076；2.岳阳天添胶囊股份有限公司，湖南 岳阳 414017）

目前，为缓解塑料等传统石油基材料制品造成的环境压力，可再生、降解的生物基膜材料成为研究的热点。淀粉由于其来源广泛、价格低廉、可再生且无毒，被广泛应用于膜材料的研发。传统淀粉基膜存在机械性能差和易吸收水分等缺点，改性和共混是改善其性能的重要手段。Zou Yiyuan等[1]采用玉米淀粉（corn starch，CS）和魔芋葡甘露聚糖制备了均一性好、可降解、高性能的CS基膜，其具有良好的抗拉强度、断裂伸长率和抗水性；Colivet等[2]发现交联和乙酰化改性淀粉膜比天然淀粉膜具有更好的疏水性和机械性能；Lermen等[3]以烷基烯酮二聚体对淀粉改性制备疏水淀粉，并应用于水果保鲜，研究表明该改性淀粉膜具有较好的保鲜效果。

精油和植物提取物对真菌和细菌有很强的抵抗性，将其添加到复合膜中，能够赋予膜较好的抗菌活性[4]。柑橘皮为柑橘食用或加工后的副产物，富含多酚、精油等活性化合物。陈皮精油（orange peel essential oil，OPO）是从柑橘皮中提取得到的，其抗菌活性高、生产成本低，在食品行业具有很高的经济价值。Alparslan等[5]以壳聚糖和2%的OPO组合制备的复合膜有较强的抗菌活性。但精油具有疏水性，与亲水性多糖相容性较差，导致膜均一性下降。精油乳化剂多数采用吐温-80，其对人体存在一定危害，且吐温-80乳化精油会降低膜的强度[6]。纤维素纳米晶（cellulose nanocrystals，CNC）主要来源于木材、棉花等，是具有高度结晶区的生物质纳米材料。其具有比表面积大、结晶度高、力学强度大、稳定性好和生物活性高等优点[7]。CNC在乳液中会发生弯曲，将油相包裹，并吸附在水油界面，阻碍液滴的聚集，是绿色环保的乳液稳定材料[8]。

本实验以CS为基质，采用柠檬酸为交联剂对CS进行疏水改性，采用CNC乳化OPO制备CNC-OPO Pickering乳液作为抗菌剂，辅以甘油作为增塑剂，采用流延法制备CS/CNC-OPO疏水抗菌增强复合膜。然后探究OPO和CNC的添加量对抗菌复合膜性能的影响，并采用傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）光谱和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）对复合膜进行表征。本研究提供了一种兼具有疏水和抗菌，且强度好的淀粉基复合膜的制备方法，在食品包装领域具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CS 新乡良润谷物食品有限公司；CNC（2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化法制备）天津市木精灵生物科技有限公司；OPO 广州万鸿生物科技有限公司；柠檬酸、甘油 国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

YQ-Z-48A白度颜色测定仪、WAL-300B卧式电脑拉力仪 杭州轻通博科自动化技术有限公司；FCA2000A1水接触角测定仪 上海艾飞思精密仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；XHF-DY高速乳化机 宁波新芝生物科技股份有限公司；CX41 SEM 日本奥林巴斯株式会社；D/MAX2200 XRD仪 日本理学电机株式会社。

1.3 方法

1.3.1 CNC-OPO Pickering乳液的制备

称取一定量的CNC超声处理30 min，得到CNC水悬液，再加入一定量的OPO，将混合液在8000 r/min条件下高速乳化180 s，制备CNC-OPO Pickering乳液。CNC添加量分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%（基于CS的干质量）；OPO添加量分别为0%、11%、22%和33%（基于CNC溶液的体积）。

1.3.2 CS/CNC-OPO膜的制备

将6%的CS分散到蒸馏水中，90 ℃搅拌30 min，加入22%的甘油和5%的柠檬酸（基于CS的干质量）混合15 min，加入CNC-OPO Pickering乳液，30 ℃条件下成膜溶液以3000 r/min分散5 min，然后采用流延法在聚丙烯模具上成膜，30 ℃真空干燥得到CS/CNC-OPO抗菌复合膜，实验流程如图1所示。制备抗菌复合膜的工艺参数如表1所示。采用质量降低法测定该复合淀粉膜中精油在30 ℃、真空干燥12 h的挥发率仅为2.38%，因此本实验后续研究未考虑OPO干燥过程中的挥发影响。

图1 CS/CNC-OPO膜的制备流程图Fig.1 Flow chart for the preparation of the CS/CNC-OPO film

1.3.3 CNC-OPO乳液的形态观察

取微量CNC-OPO Pickering乳液于载玻片上，用配有数码相机的光学显微镜（×100）观察乳化液滴的形态。

1.3.4 CS/CNC-OPO膜的性能测定

1.3.4.1 色度

试样的颜色使用白度仪进行测量，以校准白板对白度仪进行校准。测量试样的L*（亮度）、a*（红绿色）、b*（黄蓝色）值，分别根据式（1）和（2）计算C*（颜色强度）和ΔE（总色差）：

式中：L0*、a0*、b0*为校准白板的颜色参数，其值分别为91.7、-0.98、3.2。

1.3.4.2 拉伸强度和断裂伸长率

根据ASTM标准方法，采用卧式拉力仪测量样品的拉伸强度和断裂伸长率，测量前试样在60%相对湿度（relative humidity，RH）条件下保存48 h，分别根据式（3）和（4）计算试样的拉伸强度和断裂伸长率：

式中：F为拉力/N；A为试样横截面积/m2；L1为试样初始长度/m；L2为试样拉伸后长度/m。

1.3.4.3 水中溶解度（water solubility，WS）

将试样裁剪成25 mm×25 mm的大小并进行称质量，记录其初始质量。然后将试样置于50 mL蒸馏水中，在25 ℃条件下180 r/min振荡6 h。取出试样，110 ℃干燥5 h，称质量。根据式（5）计算试样的WS：

式中：m1为试样初始质量/g；m2为试样干燥后质量/g。

1.3.4.4 水蒸气透过率（water vapor transmittance，WVP）

参考ASTME96/E96M-10标准检测方法，采用干燥剂法。称重杯中加入15 g硅胶保持杯内RH值为0%，再将直径略大于称重杯的试样密封在称重杯上方。将称重杯置于温度为25 ℃、RH值为60%的环境中，记录称重杯的质量变化。根据式（6）计算试样的WVP：

式中：ΔG为称重杯的质量变化/g；d为样品的厚度/m；A为试样面积/m2；t为时间间隔/h；ΔP为试样两侧压差/kPa。

1.3.4.5 水接触角

将试样切割成10 mm×50 mm的长条，使用微量进样器在薄膜表面放置去离子水滴，采用接触角测量仪测定试样的水接触角。

1.3.4.6 抗菌性能

通过薄膜对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌区大小来判断抗菌性能。首先，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养于琼脂培养基中，以激活微生物。然后用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制备细菌悬液，均匀涂布在琼脂培养基上。在琼脂培养基表面覆盖直径为9 mm的试样，37 ℃培养24 h。

1.3.5 FTIR光谱

利用真空光谱仪测定试样的FTIR光谱。将试样与KBr按照质量比1∶100混合研磨，再使用压片机压制成透明薄片。FTIR仪扫描范围为4000～400 cm-1，分辨率为2 cm-1。

1.3.6 XRD光谱

采用射线源Cu-Kα线的X射线聚焦衍射仪测量样品的XRD图谱。测量数据采集范围为5°～90°，采集速度为5 °/min。以MDI Jade和Origin软件进行分析处理，通过计算结晶面积和总衍射面积的比值估算相对结晶度（relative crystallinity，RC），计算如式（7）所示：

式中：AC为结晶面积，Aα为XRD图上的非晶区域面积。

1.3.7 SEM观察微观结构

将试样裁剪成10 mm×10 mm尺寸作为表面形貌试样，CS/CNC-OPO膜使用拉力仪断裂制备横截面分析试样。扫描前，在真空条件下对试样进行喷金，再放入样品室，通入氮气至与室外压力相同，用热场发射SEM在5.0 kV电压条件下观察试样的表面和横截面形貌。

1.4 统计分析

采用SPSS 25软件进行数据统计，Duncan多重比较进行显著性分析（P＜0.05），采用Origin 2021作图，所有数据以的形式表示。

2 结果与分析

2.1 CNC-OPO Picking乳液的形态观察

由图2可以看出，当OPO添加量为11%时，由于精油的疏水性，未添加CNC时，乳液颗粒较大且乳液尺寸差异明显。当CNC添加量从0%增加到2.5%时，乳液颗粒逐渐减小，同时乳液的大小趋向均一。其中，当CNC添加量大于1.0%时，图像出现明显的阴影区域，这是由于CNC-OPO Pickering出现聚集，且随着CNC的增加区域增大，这可能是因过多的CNC发生了聚集，带动液滴成团[9]；当CNC添加量为2.0%时，随着OPO添加量增多，油水比增大，CNC吸附在油水界面上使得聚集情况得到改善，阴影区域减少[10]。CNC和OPO比例影响着Pickering乳液的分散和乳化效果，C1E11和C2E22有着较好的分散性和乳化性，因此CNC和OPO的最适比例为1∶11（g/mL，下同）。

图2 CNC-OPO Pickering乳液的光学显微镜图像Fig.2 Optical microscopic images of CNC-OPO Pickering emulsions

由图3可知，OPO为无色透明液体。C0E11水油分层明显，说明其稳定性较差，难以与水相混合。加入CNC后出现明显的乳化层，当OPO添加量为11%时，C0.5E11和C1E11均未出现分层，然而CNC添加量高于1.0%，乳液逐渐出现分层现象，且随着CNC添加量的增加，分层速度加快。当CNC添加量为2.0%时，随着OPO添加量增多，Picking乳液分层速度变快，乳化层减少，这是由于CNC相对含量过低不能在油水界面形成紧密堆积[11]。当OPO添加量达到33%时，乳化层上方出现油滴颗粒，此时CNC的乳化效果减弱。这说明CNC和OPO的添加量影响着Pickering乳液的稳定性和乳化性，CNC添加量过高，乳化层和水层分层加快；OPO添加量过高，Pickering乳液乳化不充分。其中，CNC和OPO比例为1∶11时，综合性能最好。

图3 CNC-OPO Pickering乳液的照片（30 min）Fig.3 Photos of CNC-OPO Pickering emulsions (30 min)

2.2 FTIR分析

由图4A可知，CS/CNC-OPO膜在3440 cm-1的吸收峰对应于O—H的拉伸振动，1020 cm-1和1080 cm-1的吸收峰对应于O—C拉伸振动[12]。在2940 cm-1处的吸收峰是—CH的对称振动峰。1465～1280 cm-1主要是葡萄糖环上O—H和C—H的形变振动。1643 cm-1处的吸收峰是结晶水的伸缩振动[13]。在加入CNC和OPO后，C2E0和C2E22的FTIR光谱在1728 cm-1处出现一个新的特征峰值，这是酯基和羰基中C＝O官能团的拉伸振动，表明柠檬酸成功交联形成新的官能团[14]。C2E22在1290 cm-1处出现了新的特征峰，根据Pan Shaowei[15]和Ilharco[16]等的报道，这是OPO所具有的特征吸收峰。从FTIR图可知，柠檬酸成功交联葡萄糖分子链，CNC-OPO Pickering乳液成功嵌入CS基质。

图4 C0E0、C2E0和C2E22膜的FTIR（A）和XRD（B）图Fig.4 FTIR spectra (A) and XRD patterns (B) of C0E0,C2E0 and C2E22 films

2.3 XRD分析

图4B为C0E0、C2E0和C2E22复合膜的XRD图谱。由图可知，CS/CNC-OPO膜在17°、19.6°和22°有3 个明显的特征峰，属于B型结构。这是因为高温糊化破坏了淀粉结构，冷却后淀粉链和脂质络合物重新聚合[17]。与C0E0相比，C2E0和C2E22在19.6°和22°处的峰值明显增强。这是因为强氧化处理的CNC在这两处附近存在衍射峰[18]。复合膜的RC从31.90%（C0E0）提高到41.98%（C2E0），CNC的加入可以提高整个共混物的结晶度。然而，加入OPO后C2E22晶型结构并未发生明显的变化，但C2E22的RC降低到36.91%，说明OPO的加入降低了复合薄膜的结晶度[19]。

2.4 微观结构分析

由图5可以看出，C0E0表面和内部截面较为光滑平整。添加CNC后，C2E0表面光滑且无杂质，截面也更为平整紧密。这是因为CNC纳米颗粒嵌入薄膜内部，同时柠檬酸交联使葡萄糖大分子链结合更加紧密[20]。加入OPO后，CS/CNC-OPO膜表面较为粗糙，内部也出现孔洞[21]，且随着OPO添加量的增加，内部孔洞数量增多。当OPO添加量为11%时，随着CNC添加量的增加，CS/CNC-OPO膜的表面变得更加平滑，内部孔洞也变小。这说明CNC和CS基质混合均匀，且为连续相。整体而言，CNC的加入可以有效改善OPO和CS基质的相容性，增加复合膜的表面平滑度。

图5 淀粉基复合膜的表面和横截面形貌的SEM图Fig.5 Surface and cross-sectional SEM images of starch-based composite films

2.5 淀粉基复合膜色度结果分析

表2为不同OPO和CNC添加量的CS/CNC-OPO膜的色度，L*、a*和b*值分别表示亮度、红绿色和黄蓝色。L*和b*值都为正值，a*为负值，说明CS/CNC-OPO膜颜色偏黄绿色。OPO的加入使a*值明显下降，说明OPO的加入对CS/CNC-OPO膜的色度有主要影响。当OPO添加量为33%时，复合膜的颜色强度C*和总色差ΔE最高。这是因为淀粉膜多为无色透明，在成膜溶液中加入有色物质时，所制备的膜通常会附带相同的颜色，当有色物质颜色越深、加入量越多时，复合膜所显示出来的颜色越明显[22]。

表2 CS/CNC-OPO膜的色度Table 2 Color parameters of the CS/CNC-OPO film

2.6 OPO和CNC添加量对CS/CNC-OPO膜强度性能的影响

拉伸强度和断裂伸长率是CS/CNC-OPO膜机械性能的重要指标，拉伸强度提供了CS/CNC-OPO膜的断裂抗力，断裂伸长率则代表CS/CNC-OPO膜的柔软度。从图6可以看出，CNC使得CS/CNC-OPO膜的拉伸强度明显增强，断裂伸长率减小，这与Travalini等[23]使用纤维素纳米纤维增强木薯淀粉膜的研究结果相同。当OPO添加量为11%时，随着CNC的添加量从0%增加到2.0%，CS/CNCOPO膜的拉伸强度从4.47 MPa增大到7.20 MPa，增加了61.1%，其中C1E11的拉伸强度为6.01 MPa。然而，当CNC添加量增加到2.5%时，拉伸强度降低至6.79 MPa，这是由于CNC添加量过高时会发生自聚集，CS/CNC-OPO膜的内部张力出现差异[24]。随着CNC的添加量增加，CS/CNC-OPO膜的断裂伸长率则出现先降低后升高的趋势，当CNC添加量从0%达到2.0%时，断裂伸长率从55.79%下降到32.7%。

图6 CNC添加量对CS/CNC-OPO膜拉伸强度和断裂伸长率的影响Fig.6 Effect of CNC addition on the tensile strength and elongation at break of the CS/CNC-OPO film

由图7可以看出，当CNC添加量为2.0%时，随着OPO添加量增加，CS/CNC-OPO膜的拉伸强度降低；CS/CNC-OPO膜的断裂伸长率先增大后减小。这是因为OPO的加入干扰了CS和CNC聚合物链之间羟基的相互作用，促进聚合物链的运动，提高了CS/CNC-OPO膜的柔软性和弹性，降低了刚性和强度[25]，所以拉伸强度降低，断裂伸长率增加。但精油过量会造成膜内部孔隙过大，在拉伸过程中孔隙部位会提前断裂，断裂伸长率减小。

图7 OPO添加量对CS/CNC-OPO膜拉伸强度和断裂伸长率的影响Fig.7 Effect of OPO content on tensile strength and elongation at break of the CS/CNC-OPO film

2.7 OPO和CNC添加量对CS/CNC-OPO膜WVP和WS的影响

由图8可知，与C0E0相比，柠檬酸的交联作用使CS/CNC-OPO膜基质中的羟基变为酯基，同时使CS/CNCOPO膜中聚合物链结合更加紧密，减少了水通道和水依附点，使CS/CNC-OPO膜的WVP大幅下降[26]。其中，当OPO添加量为11%时，随着CNC的增加，CS/CNCOPO膜的WVP呈现先减小后增大的趋势。CNC添加量为1.0%时，WVP相较于C0E0降低52.1%，达到最小值1.03×10-3g/（m·h·kPa）。这是由于CNC纳米结构嵌入在CS/CNC-OPO膜的孔隙中形成了致密结构，阻止了水蒸气的透过。但CNC中也存在大量羟基，添加量过高时为水分子提供了大量的结合位点，WVP增大。与C0E0相比，C0E11的WS增大，且随着CNC添加量增加，CS/CNC-OPO膜的WS先减小后增大。膜的厚度、表面粗糙度和内部孔洞都会增大与水的接触面积，从而影响WS。OPO和CNC的加入会明显影响CS/CNC-OPO膜的厚度、表面粗糙度和内部孔隙率，其中OPO和CNC比例有着关键作用。从图8可以看出，当CNC和OPO比例为1∶11时，复合膜的WVP低，WS最小（19.13%）。

图8 CNC添加量对CS/CNC-OPO膜WVP和WS的影响Fig.8 Effect of CNC addition on the water vapor permeability and water solubility of the CS/CNC-OPO film

图9为不同OPO添加量下CS/CNC-OPO膜的WVP和WS。当CNC添加量为2.0%时，随着OPO添加量从0%增加到33%，复合膜的WVP从1.163×10-3g/（m·h·kPa）逐渐增大到1.382×10-3g/（m·h·kPa），WS也增大到22.38%。Evangelho等[27]也发现精油的加入让CS膜的WS升高。这是因为CNC-OPO Pickering乳液嵌入在CS/CNC-OPO膜内部，乳液的大小和数量会为水分子的通过提供自由空间，从而影响WVP和WS。随着OPO添加量的增多，CS/CNC-OPO膜表面更为粗糙、厚度增加、内部孔隙更大，从而增加水分子的内部通道和水接触面积。所有CS/CNC-OPO膜的WVP都比CS膜低，说明其作为食品包装材料的性能得到明显提升。

图9 OPO添加量对CS/CNC-OPO膜WVP和WS的影响Fig.9 Effect of OPO addition on the water vapor permeability and water solubility of the CS/CNC-OPO film

2.8 OPO和CNC添加量对CS/CNC-OPO膜水接触角的影响

水接触角表示薄膜表面的亲水/疏水性，图10为不同CS/CNC-OPO膜的水接触角情况。相较于C0E0，C2E0的接触角出现增大，这是因为柠檬酸的加入，淀粉分子的羟基被消耗，生成疏水性酯基。当CNC添加量为2.0%时，随着OPO添加量从0%增加到33%，CS/CNC-OPO膜的水接触角从56.08°增大到88.13°，增大了57.2%，这是因为OPO中的酯类物质会迁移到膜表面，从而增加CS/CNC-OPO膜的表面疏水性[28]。Oyekanmi等[29]也发现纯CS的表面疏水性较低，加入油类物质可以有效提高淀粉基膜的表面疏水性。当OPO添加量为11%时，CNC从0%增加到2.5%过程中，CS/CNC-OPO膜的水接触角先增大后减小，其中C1E11的水接触角最大，为74.53°。这是因为CNC的分散作用，改善了OPO的聚集，促进OPO向膜表面迁移，表面疏水性增大；但大量的CNC会使膜的表面疏水性受其分子链羟基的影响而减小。

图10 OPO和CNC添加量对CS/CNC-OPO膜水接触角的影响Fig.10 Effect of the addition of OPO and CNC on the water contact angle of the CS/CNC-OPO film

2.9 OPO和CNC添加量对CS/CNC-OPO膜抗菌性能的影响

由图11可知，C0E0和C2E0几乎不存在抑菌面积，加入OPO的复合膜的抑菌面积明显增大，说明OPO为CS/CNC-OPO膜提供了抗菌性能。当CNC添加量为2.0%时，随着OPO的加入，CS/CNC-OPO膜对大肠杆菌的抑菌面积从C2E11的70.54 mm2逐渐增大到C2E33的203.53 mm2，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈从82.30 mm2逐渐增大到262.21 mm2。

图11 CNC和OPO添加量对CS/CNC-OPO膜的抗菌性能的影响Fig.11 Effect of the addition of CNC and OPO on the antimicrobial activity of the CS/CNC-OPO film

OPO是易挥发物质，CNC的加入不仅可以乳化分散OPO，其分子链上的羟基也提供了与淀粉分子链的氢键结合位点，对OPO的挥发起到缓释作用[30]。从图11可以看出，当OPO添加量为11%时，随着CNC添加量的增加，CS/CNC-OPO膜的抑菌面积先增大后减小，当CNC添加量为1%时，CS/CNC-OPO膜（C1E11）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌面积最大为88.4 mm2和96.45 mm2。说明CNC与OPO比例为1∶11时，缓释效果最好。其中，CS/CNC-OPO膜对金黄色葡萄球菌的抑菌面积比大肠杆菌更大，说明CS/CNC-OPO膜对革兰氏阳性菌的抗菌性更强。

3 结论

本研究以CS为基质、柠檬酸为交联剂，以CNC乳化OPO制备的Pickering乳液，采用流延法成功制备了CS/CNC-OPO复合膜。柠檬酸交联显著降低了CS/CNCOPO膜的WVP，CNC对OPO有缓释作用，适当增加CNC添加量能改善Pickering乳液对复合膜表面平滑度和内部结构的影响，同时两者的添加量影响复合膜的性能。相较于CS膜，当OPO添加量为11%、CNC和OPO比例为1∶11（g/mL）时，CS/CNC-OPO膜的WVP降低52.1%，水接触角为74.53°，拉伸强度为6.01 MPa；C1E11对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌面积最大，分别为88.4 mm2和96.45 mm2。该淀粉基膜强度好、阻隔和抗菌性能强，且有一定的疏水性能，在食品包装领域具有广阔的应用前景。