黄芩、猫眼草、连翘单味中药体外抗HIV-1病毒活性的研究*

李承乘,张清燕,刘 真,邓博文,杨瑶瑶,沈俊岭,李 强

(河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心,河南 郑州 450000)

全球人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人数已超过6 000万,约3 000万感染者死于艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),使得目前AIDS的防治任务依然十分艰巨[1-2]。AIDS的治疗主要采取两种方案,即高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)和中医药治疗。HAART疗法临床效果显著,但有毒副作用大、耐药率高等缺陷。中药在传统理论研究与应用方面有着坚实的基础,研究[3-4]证明中药能有效降低HIV病毒载量,减缓AIDS病情。部分中医药复方也具有抗病毒作用[5-8]。因此筛选出更多有效的抗HIV中药具有重要意义。祛毒颗粒是临床治疗HIV的常用中药复方,由黄芩、连翘、猫眼草、红辣蓼、生甘草等组成,有解毒散结之功效,临床效果较好,毒副反应小。方中黄芩清热燥湿,泻火解毒,为君药;连翘清热解毒,散热消痈,为臣药;猫眼草祛痰散结,拔毒杀虫,为佐药。本研究从体外实验角度探索组方中黄芩、猫眼草、连翘单味中药的抗病毒效果,选用重组质粒PLAI(含HIV包膜蛋白基因)和JRFC(含HIV骨架基因)制备假病毒,建立抗HIV-1药物筛选平台,观察黄芩、猫眼草、连翘单味中药对HIV假病毒感染MAGI-CCR5细胞系的影响,评价其抗病毒作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株

293T细胞,来源于中国科学院细胞库,批号GNHu17;DH5α大肠杆菌感受态细胞, 来源于生工生物工程(上海)股份有限公司,批号B528413;MAGI-CCR5细胞,重组质粒PLAI、JRFC,由中国科学院上海巴斯德研究所赠送。

1.2 药品、试剂与仪器

黄芩、连翘和猫眼草水煎剂由河南中医药大学第一附属医院药学部制备。分别取黄芩、连翘和猫眼草各50 g,加入500 mL纯水,使用加热回流系统水煎3次,每次1 h。浓缩药液,最终制得35 mL浸膏。取500 μL 浸膏,加入2 mL DMEM培养基,混匀后过滤备用。培养基DMEM,美国海克隆公司产品,批号SH30022.01;质粒提取试剂盒,德国Macherey-Nagel公司产品,批号740410.50;脂质体2 000转染试剂盒,美国英杰公司产品,批号11668019;荧光素酶检测试剂盒, 普洛麦格生物技术公司产品,批号E1501。NanoVue Plus型核酸蛋白定量测定仪,美国通用电气公司产品;E1501型荧光素酶检测系统,普洛麦格生物技术公司产品。

1.3 重组质粒的保存与鉴定

取制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液100 μL,加入30 μL质粒混匀,置于冰水混合物中45 min,43 ℃水浴中90 s,再转移至冰浴中冷却15 min;管内加800 μL无抗性LB培养基混匀,置于摇床上以振幅40 mm、转速150 r/min、37 ℃下培养1 h;转移感受态细胞至氨苄抗性的LB琼脂培养基,37 ℃培养过夜;挑取转染成功的大肠杆菌菌株大量扩增,提取质粒,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定及荧光素酶报告基因测序;冻存转化成功的菌落。

1.4 假病毒筛选平台的构建

将293T细胞传代至密度为80%左右;按照 3∶1比例加入质粒PLAI和JRFC共 8 μg,脂质体 2 000 转染试剂 8 μL,共转染293T细胞,置于37 ℃、体积分数50 mL /L CO2培养箱中;6 h后更换为含血清的完全培养基继续孵育48 h;收集病毒上清液,稀释为不同浓度梯度,感染MAGI-CCR5细胞。将空白细胞设为对照组;将空白细胞加不同浓度病毒上清液设为实验组,设5个梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16),每个梯度4个复孔。采用荧光素酶检测试剂,在化学发光仪上测定每孔的相对荧光单位(relative light unit, RLU)以测定假病毒活性滴度,判断假病毒筛选平台是否构建成功。进行半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)测定,选取100TCID50病毒量用于药物抑制试验。

1.5 检测指标

1.5.1 对MAGI-CCR5细胞无毒性的单味中药溶液质量分数筛选

通过中药水煎液体外对MAGI-CCR5细胞的毒性实验确定药物的相对安全剂量,采用MTT法检测单味中药对MAGI-CCR5细胞增殖情况的影响。将MAGI-CCR5细胞接种于96孔板中,在37 ℃、体积分数50 mL /L CO2条件下培养过夜;弃上清液,重新加入完全培养基DMEM。将空白细胞设为对照组,加入100 μL完全培养基;将空白细胞加中药设为实验组。以制备好的中药水煎剂为初始浓度,10倍比稀释加入培养板中,每孔100 μL,设置6个梯度(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000),每梯度4个复孔;96孔板置于37 ℃、50 mL /L CO2条件下培养48 h;计数检测MAGI-CCR5细胞生长状态,筛选出对细胞无毒性的最合适质量分数。

1.5.2 单味中药体外假病毒感染MAGI-CCR5细胞抑制实验

将96孔板中MAGI-CCR5细胞培养基上清液弃去,设置对照组1为空白细胞,对照组2为空白细胞加病毒,实验组为空白细胞加病毒加中药;各组别药物以上述毒性实验筛选出的最合适质量分数为初始质量分数,2倍等比稀释,设置8个稀释梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128);除对照组1外,每孔加入50 μL病毒(100TCID50),在37 ℃、50 mL/L CO2下培养6 h后,将对照组2更换为完全培养基,将实验组更换为不同质量分数的中药煎液;48 h后,荧光素酶检测试剂盒测定每孔RLU。计算药物对假病毒的抑制率。抑制率=[1-(实验组发光值-对照组1发光值)/(对照组2发光值-对照组1发光值)]×100%

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 假病毒筛选平台构建结果

实验组不同浓度梯度的相对荧光单位均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。结果表明,假病毒筛选药物平台构建成功。

表1 不同浓度梯度病毒上清液感染MAGI-CCR5细胞的荧光素酶值对比

2.2 3种单味中药对MAGI-CCR5细胞的无毒质量分数筛选结果

黄芩、猫眼草、连翘单味中药对MAGI-CCR5细胞的毒性较小,高剂量有毒性作用,低剂量无毒作用(P<0.05),甚至部分药物的最低剂量对细胞有促进增殖作用(P>0.05)。药物对细胞的抑制增殖作用呈现出剂量依赖性趋势。黄芩、猫眼草、连翘均在药物稀释比例为1∶100 000时对细胞的增殖不再具有抑制作用,因此选择2.17 mg/L黄芩、3.45 mg/L猫眼草、2.50 mg/L连翘作为其抗病毒研究起始剂量。见表2。

表2 黄芩、猫眼草、连翘对MAGI-CCR5细胞的无毒质量分数筛选结果

2.3 3种单味中药体外对假病毒感染MAGI-CCR5的抑制实验结果

黄芩、猫眼草、连翘单味中药均有体外抗HIV假病毒作用,且与质量分数呈正相关趋势,分别黄芩2.17 mg/L、猫眼草3.45 mg/L、连翘2.50 mg/L时表现出最高抑制率,依次是41.87%、37.38%、14.12%。见表3。

表3 不同质量分数黄芩、猫眼草、连翘对HIV假病毒的抑制率对比

3 讨 论

研究表明,HIV-1假病毒与活病毒在细胞内复制的很多环节相同,因此在抗HIV-1药物的筛选、药物抗病毒效果评价等研究中,HIV假病毒检测系统被广泛应用[9]。多项研究利用HIV-1假病毒在细胞水平进行抗HIV-1药物的筛选、对患者体内HIV-1毒株进行耐药性分析,取得较好效果[10-12]。本研究基于重组质粒PLAI和重组质粒JRFC共转染293T细胞,成功包装出假病毒,建立抗HIV-1假病毒筛选平台,与活病毒相比具有较高的生物安全性,适用于普通实验室对抗HIV-1药物筛选的需求。在此模型中,不同稀释度的假病毒感染MAGI-CCR5细胞后,荧光素酶的表达水平与病毒稀释度呈明显的剂量依赖效应,较灵敏地体现了HIV-1的复制水平,其特点符合药理筛选模型的要求。

病毒复制的晚期步骤发生在报告基因表达之后,故检测报告基因的表达不能反映药物对病毒复制晚期的抑制情况,该方法不适用于蛋白酶等晚期过程抑制剂的活性筛选[13-14]。由于课题组所联系HIV/AIDS患者均为河南地区人员,大部分为HIV-1 B’型病毒感染,因此研究中只采用了含B亚型ENV基因的质粒制备假病毒毒株,所建立的假病毒筛选体系符合此型HIV/AIDS治疗的中药及临床中药复方的抗病毒筛选需求,后期可制备多种类型假病毒毒株以对药物进行更全面筛选,进一步优化和完善筛选平台。

现代药理学研究显示,黄芩的主要有效成分是黄酮类成分,其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素在抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫调节等方面具有较好效果[15-16]。连翘的主要成分为连翘苷和连翘酯苷,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗肿瘤、免疫调节等活性,主治热病初起、风热感冒、发热、心烦、咽喉肿痛等[17-18]。猫眼草中含有萜类、黄酮类、甾醇、挥发油和酚类等多种化学成分,具有祛寒、镇咳、平喘、拔毒止痒、利尿消肿之功。猫眼草内服有抗菌抗病毒作用,可用于治疗呼吸系统疾病,还可抗肿瘤;外用可治疗淋巴结结核、皮癣等疾病[19-20]。多种清热解毒中药如紫花地丁[21]、夏枯草[22-23]、穿心莲[24-25]、黄芩[30]、鱼腥草[26]、金银花[27-28]等对HIV病毒的增殖具有抑制作用。紫花地丁的二甲基亚砜、夏枯草的含硫多糖、穿心莲的内酯具有抗HIV病毒作用的成分。通过对中药有效成分的药理分析,发现了诸多抗HIV活性物。如：栝楼中分离出的天花粉蛋白目前已被用于AIDS的临床治疗[29]。又如：黄芩苷能够抑制HIV逆转录酶的活性,且对酶活性的抑制作用有浓度依赖关系;其对HIV-1假病毒的抑制作用随着给药浓度的增高而增大,100 μmol/L黄芩苷的抑制率为60%左右[30]。

近年来,中医药防治AIDS在中药复方的研发方面取得了较好的成果[31]。益艾康胶囊[32-33]、唐草片[34-35]、复方三黄散[36-37]、艾宁颗粒[38-39]等中药复方制剂在临床上应用较为广泛且临床效果确切。同时实验研究证明这些中药复方具有较好的抗病毒作用,使CD4淋巴细胞的比例升高、患者的机体免疫能力明显改善[40]。本研究前期建立合理的假病毒平台,利用此平台对不同质量分数的黄芩、猫眼草、连翘单味中药进行筛选,通过荧光素酶报告基因的表达检测,观察药物对HIV假病毒影响,体外筛选其抗病毒作用。结果显示：单味中药黄芩、猫眼草具有较好的体外抗HIV病毒的作用,且抗病毒作用与药物质量分数呈明显的剂量效应关系;连翘的抗HIV病毒作用相对较弱。此结果对中药的有效成分研究提供了实验依据,为开发我国自主产权的抗AIDS天然药物提供了数据支撑。