神经母细胞瘤化疗耐药机制的研究进展

林梅珍,李志杰,2*

0 引言

神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是起源于交感神经嵴的儿童常见颅外恶性实体肿瘤。1999-2007年,欧洲NB发病率约为1.2/10万,在儿童肿瘤患者中约占7%,死亡率在儿童肿瘤中占15%[1]。根据国际神经母细胞瘤风险分层 (International Neuroblastoma Risk Group,INRG),将NB患者分为低危、中危和高危型。目前,治疗NB的标准治疗方案包括手术切除、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等。治疗后,低危和中危NB患者5年生存率可达到90%,高危患者采用多种模式的综合治疗后,5年总生存率约为50%[2-6]。尽管免疫治疗、靶向治疗等是目前的研究热点,但化疗依然是临床上控制肿瘤生长的主要手段之一,手术前后合并化疗是治疗NB的首选方案。手术前化疗能缩小瘤体、减少术中出血量、加大手术成功率,术后化疗可以减少肿瘤残余量。化疗耐药是所有肿瘤治疗失败的最重要原因之一,其中也包括NB,患者对化疗药物的敏感性直接影响预后[7]。本文就NB化疗耐药机制进行阐述,旨在为临床NB患者的治疗提供相关参考。

1 细胞凋亡受阻

1.1 凋亡蛋白 细胞凋亡(程序性细胞死亡)是细胞死亡的一种重要机制,是维持机体正常生理功能和机体内环境平衡所必需的。细胞凋亡通路有两条主要途径,即外源性和内源性途径。外源性凋亡途径又称死亡受体途径,是由细胞表面的死亡受体如凋亡诱导配体受体1(Fas cell surface death receptor 1,Fas1)和肿瘤坏死因子受体家族(Tumor necrosis factor receptor family,TNF-R)介导,从而激活凋亡程序。内源性凋亡途径又称线粒体途径,通常是由应激条件、化疗试剂、药物等引起,其中涉及BCL-2家族引起的线粒体外膜通透性改变,从而激活了凋亡程序。根据功能的差异,BCL-2蛋白家族可分为两大类:促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,两者之间的平衡被破坏是肿瘤细胞获得凋亡抗性的主要原因[8]。几乎所有临床上使用的常规化疗药物都能诱导肿瘤细胞凋亡,肿瘤细胞一旦成功避开凋亡途径,则会发生化疗和放疗耐药性[9-10]。有研究表明,高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)通过ROS/ERK1/2途径抑制顺铂和依托泊苷诱导的细胞焦亡,从而增加NB细胞体外和体内的凋亡和化疗敏感性[11]。Shmakova等[12]发现,在NB细胞系Neuro2a中下调尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)会抑制细胞凋亡激活,且出现细胞休眠表型和p53水平下降。研究显示,BCL-2家族抑制剂GX15-070能引起细胞凋亡和自噬,从而提高化疗敏感性[13]。研究细胞凋亡通路的调控机制以及导致凋亡抗性的因素对于开发更有效的治疗策略至关重要。同时,应该加强针对细胞凋亡通路的抗凋亡治疗策略的研究,以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性,减少化疗耐药性的发展。继续深入研究细胞凋亡机制,寻找新的治疗靶点,将有助于提高肿瘤治疗的成功率。

1.2 剪接因子 剪接因子是参与调节可变剪接的蛋白质,在这个过程中,内含子从初级转录物中去除,而外显子被选择性地连接,以产生不同的mRNA。参与凋亡调节的基因的可变剪接通常会导致合成相反作用的蛋白质变体,这些变体可以激活或抑制程序性细胞死亡。剪接因子的2个关键家族分别是富含丝氨酸/精氨酸蛋白 (Serine/arginine-rich proteins,SR蛋白)和核不均一性核糖核蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)。SR蛋白和hnRNP家族的典型成员分别是富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)和hnRNPA1,能促进Bcl-x和Mcl-1抗凋亡剪接变体的合成。剪接因子既可以减少药物诱导的细胞凋亡,也可以增强化疗药物的促细胞凋亡作用[14]。Shi等[15]研究显示,药物抑制剪接体可以诱导NB细胞凋亡并消除体内肿瘤生长。有研究表明,MYCN是MYCN-hnRNPA1/PTBP1-PKM2通路中Warburg效应的上游参与者[16]。在NB中MYCN过表达,可引起剪接因子hnRNPA1和PTBP1上调,这2种剪接因子能促进NB细胞增殖和下游分子PKM2的差异剪接。其中,致癌异构体PKM2主要在胎儿发育过程中表达,能促进NB细胞生长的Warburg效应[17]。剪接因子在NB中对细胞凋亡和肿瘤生长起着重要的调节作用。研究剪接因子及其调控的通路,可能为NB的治疗提供新的靶点和策略。

1.3 泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS) UPS负责调节细胞内蛋白质的降解,其调节功能主要由E3泛素连接酶和去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme,DUB)发挥作用,同时参与了细胞凋亡[18-19]。Caspase是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶家族,负责调控细胞凋亡的执行步骤。E3泛素连接酶可以介导Caspase的泛素化,并促使其被降解。这种降解调控可以影响Caspase的稳态水平,从而影响细胞凋亡的进程。同时,抑制UPS可以恢复肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性[20-21]。有研究显示,UPS参与了线粒体释放细胞色素c,且沉默E3泛素连接酶可以降低NB细胞中的细胞色素c[22]。肿瘤抑制基因p53的突变是NB复发耐药的主要原因之一。研究表明,通过沉默E3泛素连接酶ITCH可以减少TP73的泛素化修饰,提高其在NB中的稳定性和表达水平,这种负调控机制可能增强TP73的活性,从而提高NB细胞对化疗的敏感性[23]。泛素连接酶E4B(Ubiquitin-conjugating enzyme E4B,UBE4B)是一种参与EGFR降解的E3/E4泛素连接酶。在化疗耐药NB细胞系中,UBE4B表达水平下降会增强其对西妥昔单抗的敏感性[24]。UPS在调控细胞凋亡和肿瘤治疗中发挥重要作用,深入研究UPS的调控机制和相关的分子信号通路,可能为开发新的肿瘤治疗策略和增强化疗药物的疗效提供新的思路。

2 药物外排

药物外排是肿瘤细胞耐药最常见的机制之一,通常是细胞毒性药物通过细胞膜转运体外排所致。由于许多抗癌药物的靶点在细胞内,所以,细胞膜转运体在化疗耐药中起重要作用。ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白是具有重要临床意义的膜蛋白,利用ATP水解释放的能量来排出化疗药物[25]。迄今为止,在人类基因组中已经发现了49种不同的ABC转运蛋白基因。转运体由2个跨膜结构域(Transmembrane domain,TMD)和2个核苷酸结合结构域(Nucleotide-binding domain,NBD)组成,前者识别和转运质膜上的底物,后者通过水解ATP产生运输所需的能量。其中,ABC转运体包括ABCA2、ABCA3、ABCB1、ABCB4(MDR2/MDR3)、ABCB5、ABCC1、ABCC2(MRP2/cMOAT)、ABCC3(MRP3)、ABCC10(MRP7)和ABCG2。与其他转运蛋白相比,糖蛋白ABCB1 (MDR1/P-gp)、多药耐药蛋白ABCC1 (MRP1)在多药耐药中最为重要[26]。

2.1 ABCB1 ABCB1也称为多药耐药基因(Multi-drug resistance 1,MDR1),主要编码一种细胞膜上的蛋白质,即P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。P-gp作为一种能量依赖的外排泵,在细胞毒性作用发生前,将与MDR相关的药物转运出细胞,从而诱导了化疗耐药性[27]。Rösch等[28]研究表明,P-gp抑制剂和ERBB家族抑制剂能有效地逆转NB对长春新碱的耐药性。P-gp和其他MDR转运体可以通过各种类型的细胞外囊泡(即外泌体和微泡),将耐药肿瘤细胞(供体)转移到药敏肿瘤细胞(受体),从而导致受体细胞在体内外均出现获得性耐药,以逃避药物带来的细胞毒性[29-30]。Sousa等[31]研究显示,细胞外囊泡可能会转移微小RNA(MicroRNA,miRNA)、长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)、蛋白质(如药物外排泵)和其他负责耐药性的相关因子,从而将肿瘤耐药性特征扩散到受体细胞。有研究表明,TP53突变可能在化疗和NB的恶性进展过程中获得[32-33]。当肿瘤暴露于DNA损伤类的化疗药物后,肿瘤细胞中的p53会过度表达,当p53基因不能阻止带有受损DNA的细胞进入复制周期,便出现耐药性,本质上是p53基因发生突变[34]。突变型p53(mutp53)是赋予肿瘤细胞化疗耐药性的关键分子,可能与耐药性相关,MDR1是mutp53靶基因。组织蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)通过上调ABCB1和ABCG2的表达水平,同时抑制细胞自噬和凋亡途径,从而降低NB细胞对顺铂和阿霉素的敏感性[35]。研究ABC转运体、细胞外囊泡、TP53突变等对于理解NB细胞耐药性的机制以及寻找逆转耐药性的治疗方法具有重要意义。

2.2 ABCC1 ABCC1也称多药耐药相关蛋白1(Multi-drug resistant associate protein 1,MRP1),ABCC1基因的上调与NB患者的预后密切相关。此外,ABCC1受MYCN基因的转录调控,MYCN是神经母细胞瘤发生的驱动因素。MYCN基因的扩增发生在大约20%～30%的原发性NB中,并且始终与不良临床结果相关。NB治疗中使用的许多一线药物是MRP1底物,包括依托泊苷、多柔比星、长春新碱和拓扑替康[36]。有研究显示,MRP1缺失增强了长春新碱和依托泊苷的药物敏感性,显著延缓肿瘤生长,表明MRP1在体内介导化学抗性[37-38]。Lucianò等[39]发现,在NB中,M2受体激动剂,可以减少药物射流泵的表达,有助于化疗药物进入细胞,并停留在细胞内部,从而增加药物在细胞内的积累并增强其毒性作用,即使在低剂量下也可以实现这种效果。MRP1在NB中的高表达与不良预后相关,通过干扰MRP1蛋白功能或利用M2受体激动剂,可以增加化疗药物的疗效,减少化疗药物的泵出,从而提高药物在肿瘤细胞内的积累并增强其治疗效果。这也为开发针对MRP1的治疗策略提供了指导和依据。

3 DNA修复增强

化疗药物可直接或间接引起肿瘤细胞的DNA损伤,进而杀死肿瘤细胞。当基因组内出现各种损伤时,DNA损伤修复能力是决定肿瘤细胞对化疗敏感性的重要因素[40]。其中,DNA修复的途径包括碱基切除修复(Base excision repair,BER)、核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair,NER)、错配修复(Mismatch repair,MMR)、DNA双链断裂修复(DNA double-strand break repair,DSBs)等[40]。通常情况下,DNA修复不完全后,细胞会发生凋亡。铂类药物(如顺铂、奥沙利铂和卡铂)通过与DNA分子交联而导致DNA损伤,从而诱导细胞凋亡和细胞死亡。负责DNA修复的基因中的遗传缺陷,如MSH2和MLH1,可导致肿瘤细胞对DNA损伤类药物(如拓扑替康、环磷酰胺、顺铂等)产生耐药性[26]。研究显示,在营养缺乏的MYCN非扩增NB细胞系中,耐药性主要是通过增加DNA修复和胆固醇介导的拓扑替康外流引起的;然而,在营养缺乏的MYCN扩增NB细胞系中,耐药性主要是由胆固醇介导的拓扑替康外流引起的。结果显示,在不同类型的NB细胞系中,耐药机制可能存在差异[41]。DNA损伤修复能力是影响肿瘤细胞对化疗药物敏感性的重要因素。化疗药物引起DNA损伤后,如果细胞的DNA修复能力完整,则细胞可能适应损伤并存活,从而降低化疗的效果。相反,如果细胞的DNA修复能力受损,药物引起的DNA损伤则无法修复,进而导致细胞凋亡和死亡,增强化疗的效果。

DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)是一种保护机制,通过细胞对多种内源性和外源性因子的反应来适应DNA损伤。更多情况下,DNA损伤的积累会导致基因组不稳定和致癌。尽管DDR对正常细胞的存活很重要,但也能通过克服化疗药物诱导的DNA损伤而导致肿瘤细胞产生耐药性。氧化应激诱导的DNA损伤在癌变过程中最常见[42]。有研究表明,在NB细胞系SH-SYSY中,沉默着丝粒蛋白A(Centromere protein A,CENPA)可以提高NB细胞对阿霉素和顺铂的药物敏感性,并且抑制细胞的增殖、转移[43]。研究显示,抑制组蛋白去乙酰化酶10(Histone deacetylase 10,HDAC10)与多柔比星联合使用,可以通过阻碍药物外排和增强DNA损伤来杀死NB,这为靶向化疗耐药性提供了一个新的机会[44]。此外,DDR作为一种保护机制,帮助细胞应对DNA损伤,对于维持正常细胞的稳定和避免致癌起重要作用。然而,肿瘤细胞也可以通过克服化疗药物诱导的DNA损伤并启动DDR来产生治疗耐药性。因此,深入研究DDR的调控机制,特别是在肿瘤细胞中的作用,可能有助于开发更有效的治疗策略,提高化疗效果。

4 肿瘤微环境

肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)由多种细胞组成,其中包括肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)、内皮细胞、免疫细胞、肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)、骨髓源性细胞以及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),这些细胞成分都会推动肿瘤的发展。在肿瘤微环境中的各种细胞中,CAF是TME的主要细胞成分,在获得肿瘤化疗耐药性中起到关键调节作用。CAF介导的耐药性可大致分为细胞黏附介导的耐药性(Cell adhesion-mediated drug resistance,CAM-DR)和可溶性分泌因子介导的耐药性(Soluble factor-mediated drug resistance,SFM-DR)。CAF衍生的ECM蛋白作为肿瘤化疗耐药细胞外基质,肿瘤组织中的ECM比正常组织中的ECM密度更高、硬度更高,密集而坚硬的ECM过度积聚通常会成为药物渗透到肿瘤环境的物理屏障[42]。同时,与正常基质细胞相比,CAF的p53表达水平较低,甚至缺失[45]。其中,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是TME中最丰富的浸润基质成分[46]。有研究表明,NB中端粒酶抑制剂TERF1能够逆转由TAM衍生的外泌体miR-155诱导的耐药[47]。TME是由多种细胞和细胞外基质组成的复杂环境,不同细胞成分之间的相互作用影响着肿瘤的发展和化疗耐药性。CAF、ECM、TAM、CSCs和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等成分在肿瘤的治疗中发挥关键作用。其中,CSCs和EMT表型是TME驱动的化疗耐药性的核心。了解这些成分之间的相互作用和调控机制,有助于发展新的治疗策略,克服化疗耐药性,并提高肿瘤治疗的效果。此外,深入研究CSCs和EMT的机制,有望为针对这些细胞亚群的治疗提供新的方向和策略。

4.1 CSCs CSCs是一种特殊类型的肿瘤细胞,其具有干细胞特征,包括自我更新、分化和肿瘤永生化的特性。CSCs的增殖水平较低,药物外流增加,DNA损伤修复活性高,会导致固有的化疗耐药性[45]。同时,CSCs细胞周期常处于静止状态,能有效避免化疗药物对快速分裂的靶细胞的杀伤作用,从而产生耐药性[40]。CSCs介导化疗抵抗和药物治疗后肿瘤细胞的重新增殖,使其具有高致瘤特性。CSCs在TME中获得耐药性可能导致化疗药物治疗效果不佳。研究表明,依托泊苷与磺胺嘧啶或PKCα抑制剂C2-4的两种组合治疗方案可以通过阻止EMT转变和下调GPX4活性触发铁死亡,从而增强NB干细胞对依托泊苷的敏感性[48]。研究表明,下调JARID1B通过抑制Notch通路抑制肿瘤球形成,逆转CSCs的EMT,提高NB细胞对顺铂的化学敏感性[49]。CSCs作为一种特殊亚群,具有自我更新和耐药性能力,对于肿瘤的治疗具有挑战性。通过有针对性地攻击CSCs,可能会更有效地消灭肿瘤细胞,并提高治疗的成功率。

4.2 EMT 随着治疗后化疗耐药性的发展,肿瘤表现出微环境变化,并在具有间充质特征的肿瘤细胞亚群中富集,这些变化与EMT相关。TME衍生的白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)可以诱导EMT,这是一种促进化疗耐药性的表型开关[45]。Yogev等[50]建立了NB耐药模型,从而发现获得性耐药与转移到骨髓并产生弥散性转移的细胞亚群中的EMT有关。有研究表明,uPAR能促进NB细胞中EMT,同时抑制了EGFR/ERK信号通路,并激活AKT信号通路,从而导致化疗药物耐药[12]。研究表明,EMT转录因子在NB顺铂耐药的形成过程中发挥关键作用[51]。EMT作为一种细胞转化过程,可能导致肿瘤细胞表型的转变和耐药性的增强,从而限制了化疗效果。探索如何抑制或逆转EMT过程,有可能为治疗耐药性提供新的目标和方法,提高治疗效果,增加患者的生存率。

5 影响自噬

自噬是一种细胞内环境平衡机制,负责细胞器、脂质和蛋白质的分解代谢循环,从而为能量生产和维持细胞内稳态提供底物[50]。自噬在肿瘤中具有双重作用。一方面,自噬作为一种保护机制被激活时,抑制自噬可以提高化疗对耐药肿瘤细胞的敏感性[40];另一方面,化疗引起的持续自噬可刺激“自噬性细胞死亡”,这是一种独立的细胞死亡方式,不涉及细胞凋亡,但可能伴随细胞凋亡[52]。在大多数情况下,自噬抑制细胞凋亡,说明自噬倾向于抑制细胞凋亡而不是促进细胞凋亡[53]。在接受化疗和放疗的肿瘤细胞中,首先的反应之一是自噬,这是一种去除受损蛋白质和细胞器并产生能量和代谢中间产物的细胞过程。自噬可以促进或减弱肿瘤抵抗力,这取决于自噬本质上是细胞保护还是细胞毒性。当耐药细胞缺乏凋亡能力或表现出抗凋亡能力时,诱导细胞毒性自噬的药物也可以通过诱导自噬治疗肿瘤和阻止化疗药物耐药性。此外,p53依赖的保护性自噬诱导的耐药性可能与高水平溶酶体的诱导有关[54]。研究表明,P2X7是一种受体蛋白,能够与细胞外的ATP结合并传递信号,P2X7受体B亚型可以通过抑制自噬、增加MRP型转运体的药物外流、对维甲酸产生抵抗、增加干细胞样表型、诱导EMT等使NB细胞产生耐药性,而P2X7受体A亚型则具有相反和互补的作用[55]。研究表明,下调自噬相关分子Beclin-1蛋白表达水平,可以提高NB对化疗药物的敏感性[56]。自噬在肿瘤中的双重作用为肿瘤治疗提供了复杂的挑战。对于耐药肿瘤细胞,抑制自噬可能是提高化疗敏感性的有效策略。然而,对于一些化疗引起的自噬性细胞死亡,需要深入了解其机制和潜在的疗效。

6 总结与展望

目前,化疗仍然是治疗NB的主要手段之一,化疗耐药性一直是NB治疗的主要挑战。近年来,针对NB化疗耐药机制的研究取得了一些重要进展。NB细胞的化疗耐药性形成与多个因素相关,包括细胞凋亡途径异常、DNA修复能力增强、细胞外转运泵的过度表达、肿瘤干细胞以及细胞外耐药信号通路的激活等。但临床上仍然存在内源性或获得性耐药的问题,导致部分高危NB患者缓解后仍复发。因此,需要进一步探索NB化疗耐药形成的机制,寻找可以逆转NB细胞化疗耐药的新治疗靶点。