四神丸对腹泻型肠易激综合征大鼠5-HT 信号通路表达的影响*

魏星旭 易梦妮 邓 娜 蔺晓源 周赛男△

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是以腹胀、腹痛、腹泻等症状反复发作的临床最为常见的肠易激综合征（IBS）亚型［1］，其发病率高，机制尚未明确，仍缺乏有效的治疗手段。IBS-D 中医病位在肠，属“泄泻”“腹痛”等范畴，脾失健运是其病机核心，亦与肾脏密切相关。命门火衰，火不暖土，则脾肾阳虚。四神丸是主治脾肾阳虚泄泻的经典名方，临床治疗IBS-D 效果确切［2-3］，但其作用机制还不明确。目前一致认为肠道动力异常和内脏高敏感是IBS 主要的病理生理学基础，与脑肠互动失调关系密切。5-羟色胺（5-HT）是影响IBS-D肠道功能活动的重要脑肠肽，5-HT信号通路在调节胃肠功能中具有重要的生理作用。5-HT 的合成、释放、与相应的受体结合等信号系统中任一节点出现异常，都可引起胃肠运动紊乱及内脏高敏性［4］。为了进一步揭示四神丸治疗IBS-D 的内脏敏感机制，本研究通过复制脾肾阳虚IBS-D大鼠模型，观察了其对5-HT信号通路表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，32只，雄性，SPF级，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF 实验动物中心，使用许可证号：SYXK（湘）2020-0010。经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准研究。

1.2 实验药物

四神丸（北京同仁堂，国药准字Z13020656，规格：27 g/瓶），用纯净水配成0.732 g/mL的药液。匹维溴铵片（得舒特，法国苏威制药有限公司，国药准字H20120127，规格：50 mg/片），用纯净水配成1.523 mg/mL 的药液。番泻叶购自湖南中医药大学第一附属医院，煎制成1.0 g/mL的药液。

1.3 试剂与仪器

大鼠5-HT、SERT ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：ml003125、ml028312）；5-HT、5-HT4R 一抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-1126R、bs-12054R）。STP-120 组织脱水机、HistoStar包埋机、HM325 轮转式切片机（英国赛默飞），BX43 荧光显微镜（日本奥林巴斯），Enspire 多功能酶标仪（美国Perkinelmer），Bio-Rad 蛋白印迹系统（美国伯乐），FluorChem R 超灵敏多色荧光成像分析系统（美国普诺森），Z32HK高速冷冻离心机（德国贺黙）。

1.4 分组与造模

将32 只大鼠随机分为正常组、模型组、四神丸组、得舒特组各8 只。先灌胃番泻叶水煎液（10 mL/kg，每日1次）28 d，后连续10 d进行避水应激，制备脾肾阳虚型IBS-D大鼠模型［5］。

1.5 给药方法

四神丸组给予成人等效4 倍剂量（7.32 mg/kg）的四神丸药液，得舒特组给予成人等效剂量（15.23 mg/kg）的得舒特药液，模型组给予等体积量（10 mL/kg）的纯净水，给药14 d。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 Bristol 粪便性状量表评分 末次给药后代谢笼收集大鼠粪便，按照Bristol 粪便性状7 级评分标准进行性状评分［6］。

1.6.2 内脏疼痛阈值 末次给药后将大鼠放入自制的容器中限制活动，从肛门缓慢插入带有球囊的导尿管，从20 mmHg（1 mmHg ≈0.133 kPa）开始，逐次给予递增10 mmHg 的压力刺激，当大鼠背部拱起或腹部抬离台面所对应的压力值即为疼痛阈值［7］。

1.6.3 ELISA 法检测血清中5-HT、SERT 大鼠麻醉后心脏取血，离心取血清置-80 ℃冰箱保存。从冰箱中取出血清室温复溶，严格按5-HT、SERT ELISA 试剂盒说明书操作步骤进行，使用450 nm 波长测量，建立标准曲线，计算所测样品的含量。

1.6.4 免疫组化检测结肠组织5-HT 的阳性表达 大鼠冰盒上剖腹，剪取两段结肠PBS漂洗后，一部分装入冻存管液氮中保存，一部分放入多聚甲醛液中固定。将用多聚甲醛固定好的结肠组织进行脱水、石蜡包埋、切片，滴加5-HT一抗（1∶200）4 ℃过夜、二抗37 ℃孵育30 min，DAB 显色，400 倍镜下选取棕黄色染色视野拍片分析，计算其免疫阳性染色的平均OD值。

1.6.5 Western blotting 法检测结肠组织5-HT4R 的蛋白表达 取冻存的结肠组织，依次提取蛋白，制备SDSPAGE 胶，上样，经电泳、湿转膜、封闭后，加入5-HT4R 一抗（1∶1 000），二抗室温孵育、显色。以内参蛋白β-actin的灰度值为对照，计算5-HT4R的蛋白表达。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠Bristol粪便性状量表评分比较

见表1。模型组大鼠Bristol 粪便性状量表评分较正常组明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组大鼠Bristol粪便性状量表评分均明显降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠Bristol粪便性状量表评分和内脏疼痛阈值比较（分，±s）

表1 各组大鼠Bristol粪便性状量表评分和内脏疼痛阈值比较（分，±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

内脏疼痛阈值（mmHg）94.38±4.17 48.13±3.72**88.13±5.30△△84.38±4.17△△组 别正常组模型组四神丸组得舒特组n8888 Bristol（分）4.13±0.64 6.00±0.53*3.75±0.46△4.25±0.46△

2.2 各组大鼠内脏疼痛阈值比较

见表1。模型组大鼠内脏疼痛阈值较正常组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组大鼠内脏疼痛阈值均显著升高（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠血清5-HT、SERT含量比较

见表2。与正常组比较，模型组血清5-HT 含量显著升高、SERT 含量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组5-HT含量降低、SERT含量升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清5-HT、SERT含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清5-HT、SERT含量比较（±s）

组 别正常组模型组四神丸组得舒特组n8888 5-HT（ng/mL）6.22±0.47 11.83±0.59**7.45±0.60△8.11±0.61△SERT（pg/mL）204.32±15.97 164.08±12.77**191.03±16.40△183.13±12.79△

2.4 各组大鼠结肠组织5-HT阳性表达比较

见表3、图1。模型组结肠组织5-HT 阳性表达较正常组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组5-HT 的阳性表达均降低（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸组低于得舒特组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠结肠组织5-HT阳性和5-HT4R蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠结肠组织5-HT阳性和5-HT4R蛋白表达比较（±s）

注：与得舒特组比较，*P ＜0.05。

组 别正常组模型组四神丸组得舒特组5-HT4R/β-actin 0.45±0.04 0.07±0.02**0.29±0.03*△0.14±0.03△n8888 5-HT 0.15±0.02 0.54±0.05**0.18±0.03*△△0.35±0.04△

2.5 各组大鼠结肠组织5-HT4R蛋白表达比较

见表2、图2。模型组结肠组织5-HT4R 蛋白表达较正常组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，四神丸组和得舒特组5-HT4R 蛋白表达均升高（P＜0.05 或P＜0.01），且四神丸组高于得舒特组（P＜0.05）。

图2 各组结肠组织5-HT4R蛋白电泳条带

3 讨 论

IBS-D 属中医学“泄泻”范畴，脾肾阳虚证在泄泻中的证型比例在9.21%以上［8］，因肾和脾乃先、后天之本，生理上相互补充，病理上相互影响，命门火衰，火不暖土，故见大便清稀甚至水样便，完谷不化、腹痛喜温、腰酸肢冷等症状。也有研究表明，脾肾阳虚证是IBSD 临床最为多见的证型之一，贯穿IBS-D 发病的始终［9］。四神丸出自《内科摘要》，为治疗脾肾阳虚型泄泻的经典名方，临床用于治疗IBS-D 效果显著；其重用补骨脂温肾暖脾为君；臣以肉豆蔻温脾暖胃、涩肠止泻，吴茱萸温中散寒；五味子酸敛固涩，合生姜温胃散寒，大枣补脾养胃，共为佐使。Meta 分析研究表明，四神丸治疗IBS-D 的临床有效率优于西药组，且四神丸安全性更高［10］。

目前四神丸治疗IBS-D 的实验研究主要涉及肠黏膜屏障保护、胃肠道功能改善、肠道菌群调节相关方面［11］。IBS-D 的发病机制复杂，而作为中枢神经系统（CNS）与胃肠道之间信号传导的脑肠轴则对调控肠道动力和内脏敏感性起着至关重要的作用［12］。课题组前期基于脑肠轴调控紊乱在IBS-D 发病中的作用开展了大量研究工作，从肠道动力异常角度进行了四神丸治疗脾肾阳虚IBS-D 的作用机制探讨。研究表明，四神丸治疗脾肾阳虚型IBS-D 的作用与调节脑肠肽Ghrelin、CRF 的表达有关［5，13］。尽管如此，在脾肾相关的脑肠轴理论指导下［14］，四神丸治疗IBS-D 的内脏敏感机制仍亟待研究。课题组在大量的动物实验中进行了四神丸治疗IBS-D 的量效关系研究，即四神丸高（7.32 mg/kg）、中（3.66 mg/kg）、低（1.83 mg/kg）剂量组分别给予成人等效剂量的4、2、1 倍灌胃，结果均显示以高剂量组效果最优［5，15-16］。因此，在已明确其量效关系的前提下本研究未做量效关系探讨，而直接选取高剂量给药。

5-HT是一种广泛分布于胃肠道平滑肌、肠神经系统和胃肠道传入感觉神经系统中的重要脑肠肽［17］。当胃肠受到刺激后，5-HT可通过参与脑肠轴中化学信号的改变；当CNS 和胃肠道5-HT 水平明显升高，堆积后可能触发兴奋性毒性，使迷走神经调控功能受损，引发内脏高敏感［18］。5-HT 可通过与不同受体结合产生作用，从而引发IBS-D，其中5-HT4R 与IBS-D 内脏高敏机制关系较为密切。5-HT 与5-HT4R 结合后，可开放电压敏感性钙通道，促进乙酰胆碱等神经递质释放，导致腹部疼痛不适以及内脏敏感性增强等［19］。此外，肠道中5-HT4R 也可直接参与内脏感觉信号传递［20］。SERT 作为5-HT 失活的重要跨膜转运蛋白，对5-HT具有高选择性亲和力，当5-HT发挥作用后，SERT转运蛋白快速转运5-HT 至细胞内失活，进而降低细胞外液中5-HT 的浓度［21］。故SERT 基因的表达和蛋白功能的降低会导致5-HT 的过量累积，出现脑肠轴功能失调。研究发现，IBS-D 大鼠脑、肠、血清中5-HT 水平均上升，SERT 水平下降，且SERT 蛋白及基因表达降低，内脏敏感性升高［22］。本研究显示，IBS-D模型大鼠血清中5-HT 含量增加、SERT 含量减少，结肠组织中5-HT 的阳性表达升高、5-HT4R 的蛋白表达降低，与文献报道结果一致。

本研究观察了四神丸对IBS-D 模型大鼠5-HT 信号通路表达的影响，结果显示，IBS-D 模型大鼠Bristol粪便性状量表评分升高，内脏疼痛阈值降低，内脏敏感性增强，说明模型大鼠出现了IBS-D 的内脏高敏症状。经四神丸治疗后，IBS-D大鼠Bristol粪便性状量表评分降低、内脏疼痛阈值升高，内脏敏感性减弱，提示四神丸可以有效改善IBS-D大鼠的内脏高敏感。同时，其还能降低血清5-HT 水平、升高SERT 水平，减少5-HT 在结肠组织中的阳性表达，增加5-HT4R 的蛋白表达，表明四神丸改善IBS-D 大鼠内脏高敏的作用与调控5-HT、SERT的含量及5-HT、5-HT4R的表达有关。

综上可知，四神丸可通过调节脑肠轴5-HT信号通路，改善内脏高敏感，达到治疗IBS-D 的目的。然而其调节IBS-D内脏敏感机制的其他途径仍有待深入研究。