275nm波长UVC光的皮肤安全性研究

宋承华，杨晰雅，史爱华，魏嘉丽，李虞锋，吕毅，吴荣谦

1.西安交通大学第一附属医院 a.陕西省再生医学与外科工程研究中心；b.精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心，陕西 西安 710061；2.国科温州研究院，浙江 温州 325001；3.陕西省信息光子重点实验室，陕西 西安 710049

引言

波长在200～280 nm 的C 波段紫外线（Ultraviolet C，UVC）光杀菌已广泛应用于日常生活的各个方面，如污水处理[1-3]、食品加工[4-5]、医院杀菌[6]等。临床上有部分基于UVC 光的设备已获得医疗器械许可，并在临床使用[7]，大部分设备所采用UVC 光发射光源的中心发射波长为254 nm，主要归因于254 nm 光源比较容易获得且价格低廉。但长期或者短时间大剂量暴露于254 nm UVC 光辐射下会诱导皮肤癌变，并会引起角膜损伤、角膜糜烂等眼部问题[8-9]，因此，尚未实现254 nm UVC 光在人体健康领域的实际广泛应用。

近年来新光源技术的快速发展促使研究人员对不同波长UVC 光的杀菌效果和安全性进行了大量的研究。222 nm 波长的光源已被证实在一定剂量下，既不会诱导DNA 损伤，也不会导致表皮损伤，即其在一定照射剂量下对小鼠皮肤和角膜具有一定的安全性[10-14]。然而，受限于光源自身难以获得且价格昂贵等问题，目前采用222 nm UVC-LED 作为光源的研究较少。此外，还有少量的研究聚焦于265 nm[15-16]和280 nm[17]波长。缺乏对275 nm UVC-LED 光在活体抗菌治疗中的应用及安全性的系统研究。由于色氨酸和酪氨酸在波长270～280 nm 处有很强的吸收峰，270～280 nm 波长的UVC 光通常被认为是通过破坏微生物的蛋白质结构和功能来灭活微生物[18]。而核酸的最大紫外吸收峰位于260 nm 附近，270～280 nm 波长的UVC 光对核酸损伤相对较小。因此，基于275 nm 光的医用装置具有广阔的应用前景。基于以上研究背景，在团队已有实验成果的基础上，本项目采用自主设计搭建的275 nm UVCLED 光源，对275 nm UVC-LED 光照射对皮肤细胞和血管内皮细胞生存和生长的影响加以研究，并进一步在裸鼠皮肤上对其皮肤安全性进行探索，旨在为其应用于临床提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

本实验采用6～7 周的Balb/c nude 雄鼠为研究对象，由西安交通大学实验动物中心提供，本实验过程中对动物所有的处置均符合西安交通大学医学伦理委员会的相关要求。

1.2 275 nm UVC-LED光源

本实验所采用的275 nm UVC-LED 光源由西安交通大学电信学院固态照明中心李虞锋教授团队自主设计和加工完成。光源的具体参数已在前期发表工作中加以详细介绍[19]。如图1a所示，光源系统由灯管、防水保护套管、恒流源驱动电路、3.7 V 锂电池以及电池充电器组成。灯管的总长度约为2900 mm，宽 2 mm，安装有15 块中心辐照波长为275 nm UVC 光的5050 LED 芯片（PCD-10-V1，Photon Wave Co.,Ltd.，韩国），芯片间隔距离为20 mm。如图1b所示，该UVC-LED 灯管发射UVC 光的波长范围为260～290 nm，中心辐照波长为275 nm。为了确定UVC-LED 光源的具体工作参数，在前期研究中对距离光源不同距离处发射UVC 光的功率密度进行了测定。功率密度随着与光源距离的增加呈指数下降，距离灯管1 mm 处的功率密度约为8.20 mW/cm2，距离3 mm 处约为5.00 mW/cm2，距离光源10 mm 处约为0.60 mW/cm2，距离光源15 mm 处约为0.40 mW/cm2。

图1 275 nm UVC-LED光源的构造与发射光谱图

1.3 275 nm UVC-LED光的细胞安全性研究

1.3.1 正常细胞生存

采用细胞计数试剂盒-8 [ Cell Counting Kit-8，CCK-8，东仁化学科技（上海）有限公司]测定不同照射剂量的275 nm UVC-LED 光对正常细胞生存的影响。即将处于对数生长期的人类永生化表皮细胞（Human Immortalized Keratinocytes，HaCaT，北京北纳创联生物技术研究院）和人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs，北京北纳创联生物技术研究院）用胰酶细胞消化液（上海碧云天生物技术有限公司）消化并收集后，采用无菌磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-Buffered Saline，PBS，pH=7.4，上海碧云天生物技术有限公司）离心清洗3 次，最终分散至PBS中，将细胞浓度稀释至1.5×106cells/mL。吸取40 μL细胞悬液加入定制细胞培养板（尺寸：长125 mm，宽83 mm，高17 mm，孔深10 mm，孔直径8 mm，孔间隔20 mm）中，采用275 nm UVC-LED 光源在距离孔底15 mm 的高度处（功率密度约为0.40 mW/cm2），分别照射培养板0、3、5、8、12、20 s 后（每个时间设置3 个复孔），吸取20 μL（包含3×104个细胞）细胞悬液并转移至已添加100 μL 对应培养基的96 孔板中（图2a）。继续培养48 h 后，分别给每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养孵育1～3 h 后，采用酶联免疫检测仪（Thermo公司，美国）记录每孔在450 nm 处的吸光度值，计算细胞的存活情况。细胞存活率=（实验组的吸光度值-空白吸光度值）/（对照组的吸光度值-空白吸光度值）×100%。

图2 采用275 nm UVC-LED光照射细胞培养板的操作示意图（a）和采用275 nm UVC-LED光照射小鼠背部皮肤的操作示意图（b）

1.3.2 正常细胞增殖速度

采用iCELLigence 多功能实时无标记细胞分析仪（ACEA 公司，美国）对275 nm UVC-LED 光照射对细胞增殖速度的影响进行监测，照射细胞后，吸取10 μL（包含1.5×104个细胞）细胞悬液，转移至已添加290 μL对应培养基的E-plate L8 孔板中。每个照射时间设置3 个复孔。之后，将E-plate L8 孔板放入iCELLigence系统上，确定接触完好后，以细胞增殖模式开始运行程序。共监测48 h，数据采集程序设定为1 min：1 min/次；8 h：1 min/次；40 h：15 min/次。取3 个复孔的平均值绘制细胞增殖曲线。

1.4 275 nm UVC-LED光照射对小鼠皮肤的影响

1.4.1 单次大剂量照射

将5 只BALB/c Nude 雄鼠（6～7 周）采用4%水合氯醛进行麻醉。用黑色耐酒精记号笔在其背部脊柱两侧分别标记出4 个1 cm×1 cm 的正方形标记。用275 nm UVC-LED 光源单次照射标记区域60 s（功率密度约为5.00 mW/cm2，能量密度约为300 mJ/cm2，能量密度=功率密度×照射时间），见图2b。分别在照射后0、1、5、12、24 和48 h 采集正方形内的皮肤样本（n=3），浸泡在4%多聚甲醛溶液中，过夜后进行组织学分析。

1.4.2 多次不同剂量照射

将10 只BALB/c Nude 雄鼠（6～7 周）采用4%水合氯醛进行麻醉。用黑色耐酒精记号笔在其背部脊柱两侧分别标记出4 个1 cm×1 cm 的正方形标记。275 nm UVCLED 光源分别照射标记区域0、10、20 和60 s[功率密度约为5 mW/cm2，能量密度分别为0 mJ/cm2（0 s）、50 mJ/cm2（10 s）、100 mJ/cm2（20 s）和300 mJ/cm2（60 s）]。每天照射1 次，连续照射7 d。照射后立即观察被照射皮肤的大体外观，并对小鼠背部进行照片采集。此外，分别在照射后的第7 天对被照射区域的背部皮肤进行取样。皮肤样品置于4%多聚甲醛溶液中。

1.4.3 组织学分析

本实验中的组织学分析主要委托武汉赛维尔生物科技有限公司进行操作。将收集到的皮肤组织在4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h 以上，用手术刀将目标部位修复平整，放入脱水盒中进行梯度酒精脱水后，将组织浸入融化的石蜡中。将浸好蜡的组织放入石蜡包埋剂中进行包埋。然后，采用石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）制备4 μm 厚的石蜡组织切片，进行脱蜡和补液操作后，对切片进行苏木精-伊红染色；同时，组织切片在经过脱蜡和补液操作后，将切片浸入柠檬酸抗原修复缓冲液中孵育，进行抗原修复。然后，用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性。经PBS 清洗后再用3%牛血清白蛋白进行血清封闭。为了检测环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane Pyrimidine Dimer，CPD）抗体（Kamiya Biomedical Company，美国）的形成和代谢情况，将组织切片与抗CPD 抗体在4℃下孵育过夜。然后，将切片放入PBS 中洗涤3 次，将切片与辣根过氧化物酶标记的二抗进行共孵育。在PBS 中洗涤3 次后即可加入二氨基联苯胺进行显色反应，最后进行苏木精染色即可。切片影像采用徕卡切片扫描显微成像系统获得。通过在200 倍放大倍数下，随机取5 个视野统计CPD 阳性细胞个数。

2 结果

2.1 275 nm UVC-LED光照射对正常细胞生存的影响

选用HaCaT 和HUVECs 两种细胞，研究275 nm UVC-LED 光照射对细胞生存的影响。结果如图3所示，轻微照射即可损伤一定量的HaCaT，但是照射3、5 和8 s 时对HaCaT 存活率的影响差别不大，照射8 s 时依然有超过75%的细胞存活，但照射20 s 时细胞的存活率只有10%左右。而对于HUVECs，其对275 nm UVC光的反应更加灵敏，照射3 s 和5 s 时依然有超过80%的细胞存活，但是照射8 s 时细胞存活率下降至40%，照射20 s 时只有5%左右的细胞存活。说明在低剂量直接照射时，275 nm UVC 光具有一定的皮肤相关细胞安全性。但是高剂量的275 nm UVC 光照射会对细胞产生较大伤害。

图3 采用275 nm UVC-LED光直接照射HaCaT和HUVECs不同时间后，继续培养48 h后细胞的存活情况

2.2 275 nm UVC-LED光照射对正常细胞增殖速度的影响

对275 nm UVC 光照射后对细胞增殖速度的影响研究结果如图4所示，275 nm UVC 光照射确实在一定程度上减缓了细胞的增殖速度，且随着光照剂量的增加，细胞增殖速度明显降低。相比于HaCaT，HUVECs 对275 nm UVC 光的响应更加灵敏，与细胞存活实验的结果一致。

图4 采用275 nm UVC-LED光照射HaCaT（a）和HUVECs（b）不同时间后对细胞增殖速度的影响

2.3 单次大剂量照射275 nm UVC-LED光对小鼠皮肤DNA的影响

采用大剂量275 nm UVC-LED 单次照射小鼠皮肤，通过追踪小鼠皮肤中CPD 的代谢情况来研究其是否会诱导小鼠皮肤的DNA 损伤。结果如图5所示，在275 nm UVC-LED 光单次照射60 s 后，即可在小鼠表皮中检测到CPD 表达的细胞，并发现其主要分布在棘层。但是，CPD 在小鼠皮肤中的代谢也极为迅速。在照射1 h 时，CPD 阳性的细胞个数已减少大约20%；在照射5 h 时，CPD 阳性的细胞个数已减少大约55%；在照射12 h 时，依然可在棘层上部检测到CPD 表达细胞，但其已减少至约30%；而在照射24 h 时，仅在表皮表面检测到少量的CPD 表达细胞；在照射48 h 时，超过97%的细胞中的CPD 被完全代谢。说明用275 nm UVC-LED 灯大剂量照射后，小鼠可快速修复所产生的CPD，CPD 不会在皮肤中进行累积。

图5 采用275 nm UVC-LED光单次大剂量照射小鼠皮肤后小鼠皮肤组织中CPD的表达量

2.4 多次不同剂量照射275 nm UVC-LED光对小鼠表皮损伤的影响

低光照剂量或者高光照剂量的275 nm UVC-LED 光多次照射小鼠表皮，研究其对小鼠表皮的影响。结果如图6所示，与未照射的小鼠相比，低光照剂量和高光照剂量下多次照射275 nm UVC-LED 光的小鼠皮肤完好无损，没有观察到任何晒伤、蜕皮、皮疹、水肿或者红肿等现象。

图6 采用275 nm UVC-LED光连续照射7 d小鼠背部皮肤不同时间（0、10、20和60 s）小鼠背部皮肤的变化情况

采集照射7 d 后小鼠照射区域的皮肤组织进行组织学分析，结果证实了275 nm UVC-LED 光在实验剂量下的安全性。在照射7 d 后的小鼠皮肤组织切片中未观察到组织损伤、坏死或者炎症反应等，总体与正常皮肤组织几乎没有任何区别，见图7。

图7 采用275 nm UVC-LED光连续照射7 d小鼠背部皮肤后小鼠背部皮肤组织的组织学结果

3 讨论

Freeman 等[20]在20世纪60年代发现相比于250 nm的UVC 光，波长在200～230 nm 的UVC 光诱导人体皮肤红斑的可能性大幅减少，这主要是不同波长UVC 光的穿透性决定的。研究表明200～230 nm 的UVC 光并不能穿透角质层到达真皮组织层[21]。同时，由于受到眼睛角膜层的保护作用，该波段也不能穿透角膜层到达视网膜，因此，其对眼睛的损伤也是相对较小的。但其依然可以穿透厚度远小于人体皮肤细胞的细菌以及病毒等微生物的膜结构，进而将其杀死[12,22]，提示该波段可以兼具杀菌作用的同时，减弱对人体皮肤和眼睛的伤害作用，是最有潜力应用于临床的。目前影响该技术临床推广的一个重要因素就是高质量的200～222 nm 光源昂贵的价格，且光源制造技术难度较大。

目前临床上应用最广泛的UVC 光中心波长为254 nm，一方面主要利用其大功率下的杀菌作用用于室内环境消毒；另一方面，虽然254 nm UVC 光照射下会诱导皮肤病变以及角膜损伤，但按规定的低剂量照射在杀灭患处的病原物的同时，还有促进组织生长、加速伤口恢复的功能[23-24]。将其直接用于癌症导致的口腔溃疡[25]、疱疹[26]、糖尿病足[27]、皮肤损伤及感染[28]、斑秃[29]以及术后伤口的恢复治疗[30]方面已取得一定成果。市场上短波紫外线治疗仪已不少见（如北京君德医疗设备有限公司[26,30]、廊坊市豪迈医疗器械有限公司以及廊坊市天月医疗器械有限公司等公司研发的紫外线治疗仪等）。此外，254 nm UVC 光的另外一个重要医用场景是血液制品的病原菌杀灭技术。目前已有文献报道基于254 nm UVC 光的THERAFLEX 系统用于血液中的病原菌灭活[31-33]。波长254 nm 的UVC 光在照射生物体表面特别是人体皮肤时会产生大量的CPD，阻碍DNA 的复制与转录进而造成细胞死亡，并可能引起细胞变异，进而诱发皮肤癌[34-37]。因此其应用依然存在很多限制。波长270～280 nm 的UVC 光与蛋白质的最大紫外吸收峰一致，偏离核酸的最大紫外吸收峰。因此，其主要是通过破坏微生物的蛋白质结构和功能来达到灭菌作用[18]。可见，270～280 nm UVC 光对核酸的损伤较小，且杀菌效果相对较好[19]。目前275 nm 的UVC 光主要是应用于各种手持式、壁挂式的杀菌装置，且价格容易接受。但是，几乎没有活体应用的相关报道，因此，UVC 光有一定的人体应用潜力，故对其进行安全性的研究非常有意义。

结合不同波长UVC 光的特性，本研究证明了275 nm UVC 光具有一定的细胞安全性和皮肤安全性。低剂量照射时对皮肤和血管相关细胞的存活增殖速度不会产生显著影响，且对活体使用275 nm UVC-LED光照射60 s 后，小鼠皮肤既没有发生细胞DNA 损伤，也没有表皮损伤。同时，光照射治疗的操作方法简单方便，不会产生噪音和气味污染，易于被患者接受。因此，275 nm UVCLED 光在临床治疗皮肤感染方面前景广阔。此外，虽然按照本实验中的照射条件，275 nm UVC-LED 光照射不会对皮肤造成损伤，但是其他照射剂量的275 nm UVCLED 光直接长期或者短期照射对皮肤的影响仍然未知。因此，在275 nm UVC-LED 光投入临床应用前仍有许多问题和挑战。

综上所述，275 nm UVC-LED 在一定照射剂量下既不会诱导小鼠皮肤DNA 损伤也不会引起表皮损伤，具有一定的皮肤安全性，具有临床应用前景。