响应曲面法优化醋三棱最佳炮制工艺

马洪涛，李子龙，薛青苹，胡 雨

（华润三九现代中药制药有限公司•广东 惠州•516000）

三棱为黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoleniferum,Buch.-Ham 的干燥块茎，始载于《本草拾遗》[1]。三棱生品为血中气药，具有破血行气、消积止痛的功能，多用于月经不调，积聚结块等病症，是临床常用的活血化瘀中药。经醋制后，增强破瘀、散结、止痛的作用。醋三棱的炮制方法有醋煮法、醋蒸发、醋炙法等[2]，目前临床使用最多且被2020 版《中国药典》所收载的仅有醋炙三棱。但是，该炮制方法只规定：“每100kg三棱，用醋15kg”，未明确规定炮制时间、炮制温度等工艺参数，使市售醋三棱饮片质量参差不齐，影响临床药效和安全性[3]。

现代研究表明，三棱主要含挥发油类、有机酸类、黄酮类、苯丙素类、皂苷类等化学成分，其中阿魏酸、4-香豆酸和香草酸能抗血小板凝结，与三棱活血化瘀的功效一致[4-6]。目前，《中国药典》2020 年版三棱药材项下无明确的成分定性及定量检测标准，其质量评价方法仅仅是浸出物含量测定。本实验以UPLC 检测三棱药材4-香豆酸炮制前后含量变化，以4-香豆酸和浸出物含量的综合评分为评价指标，采用响应曲面法优化炮制工艺关键参数，建立参数明确、过程可控的三棱醋炙工艺，为提高醋三棱的质量均一性和临床用药安全性提供了技术支持。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器与试剂

Waters 超高效液相色谱仪，包括四元溶剂管理器、柱温箱、二极管阵列检测器；电子分析天平：METTLER TOLEDO（XPE26、MS204S），瑞士梅特勒；KDMA 六联电热套，常州迈科诺仪器有限公司；乙腈（色谱纯，批号：JA122830），德国默克公司；甲醇（分析纯，批号：20220315），冰醋酸（分析纯，批号：20201230），国药集团化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水（批号：20220310），杭州娃哈哈集团有限公司；4-香豆酸对照品（批号：111684-202003，纯度：98.0%），中国食品药品检定研究院。

1.2 材料

实验用三棱饮片购买自亳州市场，经鉴定为2020 年版《中国药典》收载基原黑三棱的干燥块茎。

2 实验方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Waters CORTECS T3（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为35℃；检测波长为300nm。理论板数按4-香豆酸峰计算应不低于5000。

2.1.2 对照品溶液制备

取4-香豆酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1mL 含5μg 的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取本品粉末(过四号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，称定重量，加热回流1 小时，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，水浴蒸干，加甲醇溶解定容至5mL容量瓶中，即得供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察

取4-香豆酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL 含20μg 的对照品储备液。分别稀释，制备成4-香豆酸浓度为1.25、2.5、5、10、20μg•mL-1溶液。分别吸取对照品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。对照品浓度为横坐标以X 表示，峰面积为纵坐标以Y 表示，绘制标准曲线，得回归方程Y=23569X+19269，相关系数（r=0.9953），4-香豆酸在1.25～20μg•mL-1范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

吸取2.1.2 项下对照品溶液2μL，重复进样6 次，进行精密度试验，结果4-香豆酸峰面积RSD 为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

分别吸取同一供试品溶液2μL，在室温环境下0、2、4、8、16、24h 按上述色谱条件进样，测定峰面积，计算峰面积RSD 为1.50%，表明样品在24h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

相比铝合金来说，镁合金的密度要低得多，但其具有良好的铸造性能。人们通过各种各样的方法，如添加颗粒、纤维和晶须等来生产、制造以镁作为基体的镁合金复合材料。

取同一醋三棱样品，依照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法，分别平行制备6 份样品，精密吸取2μL，按上述色谱条件进样，测定峰面积。计算4-香豆酸的平均质量分数为0.0054%，RSD 为1.21%。

2.1.8 加样回收试验

称取同一批醋三棱样品粉末0.5g，共6 份，精密称定，每份加入约0.027mg 的4-香豆酸，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，分别吸取2μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积值，计算回收率和RSD 值，4-香豆酸的平均回收率为99.8%，RSD 为1.4%，表明本方法测量结果准确可靠。

2.1.9 样品测定

取响应曲面试验的样品（过四号筛）1.0g，精密称定，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别吸取2μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算各样品中4-香豆酸含量。详见图1。

图1 4-香豆酸对照品（A）及醋三棱样品（B）UPLC 图

2.2 浸出物含量测定

参照《中国药典》2020 年版醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂。

2.3 响应曲面试验

表1 醋三棱炮制工艺响应曲面实验因素水平表

对浸出物及4-香豆酸含量数据进行“归一化” 处理后进行综合加权评分，优选醋三棱的炮制工艺，浸出物和4-香豆酸的含量原则上越高越好。采用Hassan 方法进行数学转化“归一值”。

计算公式：dmax=。

由于各成分的药效贡献值大小未知，因此赋予2项指标权重各50 分，总分100 分，然后计算各试验组综合评分。计算公式：综合评分（Y）=“浸出物归一值”×50+“4-香豆酸归一值”×50[10]。具体实验安排及结果，详见表2，方差分析结果，详见表3。

表2 Box-Behnken 设计实验及结果

表3 醋三棱炮制工艺优化综合评分回归模型方差分析

通过Design Expert 12 软件对各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为Y=87.56+2.31A+2.08B+0.836C+2.96AB-0.0203AC+0.4181BC -29.78A2-10.04B2-6.06C2，通过方差分析，模型具有显著性，失拟项不显著。多元相关系数R2=0.9923，说明相关性越好，预测值R2（RPred2=0.9134）和调整后R2（RAdj2=0.9824）较为吻合，差值小于0.2，说明回归模型能充分说明工艺过程。C.V.=3.46＜10.0%，表明实验的可信度和精确度高；模型拟合精密度Adeq Precision=24.5179>4，视为合理。因此，拟合的回归方程符合以上检验原则，适应性较好。因素A、因素B、因素AB 的P＜0.05，具有显著性，各因素的影响大小为A>B>C。根据拟合模型绘制三维曲线图（图2），观察各因素的交互作用对综合评分的影响，AB 交互作用显著，AC、BC交互作用不显著。

实验设计显示，最佳炮制工艺为炒制温度151.330℃、炒制时间15.559min、闷润时间41.458min，在此工艺条件下炮制醋三棱饮片4-香豆酸及浸出物含量综合评分最高，为87.759。根据实际情况将最佳炮制工艺调整为：炒制温度150℃、炒制时间15min、闷润时间40min。因实验组中已有最佳组合，故不需要进行验证实验。

3 讨论

三棱作为临床常用中药，具有破血行气，消积止痛的作用。目前，三棱有效成分不明确，已报道的成分主要有挥发油类、有机酸类、黄酮类、苯丙素类、皂苷类等。人体内的自由基与心血管疾病有密切联系[11，12]。已有研究表明，阿魏酸和4-香豆酸有抗血小板聚集、镇痛作用。本实验选择与三棱功效相对应的代表4-香豆酸，以对成品质量影响较大的闷润时间、炒制温度和炒制时间3 个主要因素，采用响应曲面法对醋三棱醋炙工艺进行优化，与传统的正交实验和均匀试验相比，响应面法参数预测精度高，更接近真实值，可实现多个指标的筛选、优化，建立连续变量曲面模型，对各因素水平进行全面的优化研究，更直观、精确地得到最优组合。最终确定了醋三棱最佳炮制工艺，即取净三棱饮片，加15%醋，浸润40min，在150℃条件下炒制15min，为醋三棱生产炮制提供参考。