高效液相色谱法在药品成分分析中的应用及优化研究

＊亓秀华

（济南市食品药品检验检测中心 山东 250102）

近年来，药品的质量和安全问题备受关注，各国政府在加强监管的同时，对未取得《许可证》而生产、经营药品的企业和个人进行了严厉的处罚。因此对药品成分的准确分析和监测变得至关重要。高效液相色谱法（HPLC）作为一种广泛应用于药物和化学分析领域的分析技术，因其高灵敏度、分离效果好和研究广泛等优势，成为药品成分分析中最常用的方法之一。

1.液相色谱法及仪器

（1）常用液相色谱仪器。第一，质谱检测器。质谱检测器（MS-detector）是液相色谱仪中的一个主要探测器。高解析物可以在离子源中电离，并按照质荷比进行分散，以产生更高灵敏度和选择性；第二，紫外线吸收探测器。紫外线吸收探测器（UV absorption detector）可以测量产生紫外线吸收能力强的物体。一般分为恒定波长、可变波长和二极管阵列检测三个类别，能够满足各种各样的分析物；第三，光电二极管阵列检测器。光电二极管阵列检测器是一种高级形式的紫外检测器。该仪器能够同时测量多个波长的吸光度，从而提高每种分析物的检测灵敏度[1]。

（2）样品制备方法。高效液相色谱法样品制备方法会直接影响到分析结果的准确性和可靠性。为此，本文以高效液相色谱法为例，介绍一种常用的样品制备方法。

根据待测化合物的性质和溶解度，选择合适的溶剂进行样品的溶解。准确称取一定量的待测样品，并将其转移到适当的容器中。注意避免称量误差和样品的污染。将称好的样品溶解在选定的溶剂中，涡旋或超声处理以促进样品的充分溶解。注意控制溶解温度和超声功率，避免样品分解或产生副反应。若样品中含有不溶性杂质或固体颗粒，可以通过离心、过滤或萃取等方法将其去除，以避免对色谱柱的损害和色谱分离的影响。使用0.22μm或0.45μm的滤膜过滤样品溶液，以去除微小的颗粒和杂质，防止堵塞色谱柱。选择合适的进样瓶，并用乙醇或甲醇等溶剂清洗干净，晾干后备用。注意避免使用有划痕或变形的进样瓶，以免影响色谱分离效果。

2.高效液相色谱法在药品成分分析中的优化方案设计

（1）样品处理优化。药品成分分析采用固相萃取、液-液萃取、蒸馏等技术，可以将药品样品中的目标成分从复杂的样品基质中提取出来，并达到一定的浓缩效果。提高目标成分的测定灵敏度，消除某些干扰物质的影响，提高峰形对称性和信噪比[2]。药品样品处理过程中，可能会发生物化变化、光敏变化或降解，从而影响样品中目标成分的含量和测定结果。为了解决这些问题，高效液相色谱法的样品处理、安全、操作过程简便，处理效率高，能够实现联机操作，常见的样品处理技术主要包括液-液萃取、固相萃取等。

第一，液-液萃取是利用不相溶的溶剂体系，将目标成分从水溶液中抽提至有机相中的过程。这种技术可使目标成分从复杂的样品基质中分离出来，并富集浓缩，提高检测灵敏度。通常，有机相可以通过挥发性溶剂的挥发使其浓缩，减少溶剂用量和对操作人员的危害。也可以使用离子液体作为萃取剂，以减少对操作人员的危害并提高目标成分的回收率；第二，固相萃取法是指将柱色谱和液相-固萃取法相结合的样品处理工艺。它通过选用合适的吸收物（正相、反相、离子交换等），使目标成分吸附于稳定相上，然后再通过特殊的洗脱溶液除去试样中的非目标化合物，从而实现了目标元素的富集与提纯。固相萃取具有样品量少、耗溶剂少、操作简单等优点，广泛应用于基质复杂、目标成分含量低的样品处理。

（2）流动相组成优化。首先，需要选择适当的溶剂或溶剂体系。溶剂的选择应基于目标成分的性质和分离要求。常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈等，在药品成分分析中常用作流动相的溶剂。对于极性药物的分析，酸性或碱性溶剂可以添加以调整pH值，以达到良好的分离效果。其次，溶剂的选择及其配比应根据药品成分的性质、极性及其相互作用来确定。第一类溶剂，如苯、四氯化碳、1,2-氯乙烷等，由于它们不可接受的毒性和对环境的有害作用，应尽量避免使用；第二类溶剂，如乙腈、氯仿、二氯甲烷、环己烷等，由于其固有的毒性，必须在药品生产中限制使用；第三类溶剂，如乙酸、丙酮、醋酸甲酯和四氢呋喃等，按照GMP管理和产品的要求正确应用。通常，提高有机溶剂配比会增加柱的亲脂性，进而提高稀溶物的转化速度。但是，在部分特殊情形下，提高有机溶剂配比可能造成一些组分无法溶解或分散不良，所以必须在选择配比上加以优化。

（3）检测参数优化。高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于药品成分分析的分离技术。其优点包括高分离效能、高灵敏度、高选择性等。然而，为了得到准确且可靠的检测结果，参数优化是必不可少的步骤。对于不同的药品成分，流动相的组成和比例需要进行调整，以达到最佳的分离效果。在分析药材中的黄酮类化合物时，采用甲醇-水-磷酸体系作为流动相，同时调整甲醇的比例以改善分离效果。在测定抗生素类药物时，通常选择254nm作为检测波长；而在测定多肽类药物时，则可能需要选择214nm或280nm作为检测波长。

在黄酮类化合物的分析中，采用了甲醇-水-磷酸作为流动相，并将甲醇的比例调整为40:60:0.1，以达到最佳的分离效果。检测波长选择为360nm。柱温设定为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL。通过这些参数优化，获得了良好的分离效果，其中R2值表示分离效果的相关性，越接近1表示分离效果越好。通过对不同药品成分的分析和对优化参数的调整，得到了适用于黄酮类化合物、抗生素类药物和多肽类药物的最佳分析条件。这些优化后的条件能够实现目标成分的高效分离和准确测定，为药品分析提供了准确性和效率性的保证。

3.试验结果与分析

（1）药品成分分析试验。药品中除主成分以外的杂质，可能是原料药合成过程中代入的原料、中间体、试剂、分解物、副产物等物质，也可能是制剂成产过程或贮藏、运输过程中产生的降解产物。由于当前相关物质的含量较少，所以需要选择灵敏度高、重现性好的检测方法[3]。目前主要选用高效液相色谱法测定有关物质。高效液相色谱法在药品成分分析中的应用数据，见表1。

表1 高效液相色谱法在药品成分分析中的应用数据

条件1：等度色谱条件。等度色谱条件是指在色谱分离过程中，流动相的组成保持恒定不变。在这种条件下，色谱柱的温度和流速通常也保持恒定。等度色谱条件适用于分离组分间保留时间差异较大的样品。条件2：梯度色谱条件。梯度色谱条件是指在色谱分离过程中，流动相的组成随时间发生变化。通常，梯度色谱采用两种或多种不同极性的溶剂，按照预定的比例和时间程序进行混合。这种变化呈现为线性/非线性。梯度色谱条件可以提高复杂样品的分离效果，特别是对于那些保留时间相近的组分。条件3：高温色谱条件。高温色谱条件是指在较高的温度下进行的色谱分离。高温可以提高色谱柱的分离效能和速度，降低柱压降，缩短分析时间。

（2）试验结果分析。高效液相色谱法在药品成分分析中的应用显示出了极高的灵敏度和重现性，对于药品中微量杂质的检测具有显著的优越性。表中列出的五种药品，在各自的色谱条件下，均能实现良好的分离效果，其分离度均大于1.2，这表明高效液相色谱法可以有效地分离和检测药品中的主成分和杂质。同时，校正因子的数值在0.85～1.2之间，这表明在该色谱条件下，主成分和杂质的响应因子基本相同，因此可以通过峰面积的比较来直接反映杂质的含量，这对于杂质的定量检测具有重要的意义。另外，从杂质含量的数据来看，所有药品的杂质含量均低于1.5%，这表明该分析方法具有良好的准确性和精密度，可以满足药品中微量杂质的检测需求。因此，高效液相色谱法作为一种重要的分析手段，其高灵敏度、高分离效能、高重现性等优点使其在药品杂质检测中具有无可比拟的优势。

（3）优化方案验证。在流动相组成优化方面，通过试错法逐步调整溶剂比例，目的是找到能够同时满足分离和检测的最佳条件。尝试了甲醇-水和乙腈-水两种溶剂体系，并通过不同比例的混合尝试找出最佳的溶剂比例。在经过一系列试验和比较后，发现甲醇-水（60:40）的流动相组成能够在较短的时间内实现目标成分的高效分离和检测。在柱类型优化方面，选择了C18型柱和氰基型柱进行对比试验。通过在相同的流动相条件下，对比两种不同柱的分离效果和峰形，发现C18型柱具有更好的分离效果和峰形，能够更好地分离目标成分和杂质。在流速优化方面，发现当流速超过一定范围后，分离效果开始下降。因此，选择了使目标成分在1.5～2.0min内完全分离的较低流速作为最终的流速条件。流动相组成优化、柱类型优化和流速优化的数据，见表2。

表2 流动相组成优化、柱类型优化和流速优化的数据

最终，针对优化方案进行了验证，并对优化前后的结果进行了比较。优化前后目标成分峰的分离度和峰形的变化，见表3。

表3 优化前后目标成分峰的分离度和峰形的变化

在优化后的条件下进行分析，观察到目标成分峰的分离度明显提高，峰形更加对称和尖锐，并且与之前的研究相比，在相同的分析时间内，优化后的方案能够更快地完成分离和检测。

4.结论

高效液相色谱法在药品成分分析中的应用及优化研究对于提高药品分析的准确性和效率具有重要的意义。优化后的分析条件能够实现目标成分和杂质的高效分离和准确测定，提高了分析效果和准确性。同时，高效液相色谱法具有操作简便、分辨率高并且灵敏度好等优点，使其在药品成分分析中得到广泛应用。未来，新型柱材料和新的分离机制的开发将进一步提升分析性能。分离机制的研究也将拓宽高效液相色谱法在药品成分分析中的应用范围，并提供更灵敏的检测方法。