菹草腐解期上覆水浮游细菌群落动态模拟及其环境驱动因子分析*

李昂松,武 闯,朱 琳,徐丽桦,张 劲**,李兆华,蔡 伟,冯学高

(1:湖北大学资源环境学院,武汉 430062)(2:湖北大学生态文明建设研究院,武汉 430062)(3:武汉市生态环境安全中心,武汉 430062)(4:荆门市生态环境局沙洋县分局,荆门 448299)

作为陆地营养物质的主要受纳场所,江河湖库经历了氮、磷等营养物质的长期富集。这导致了水体富营养化和水生态系统的退化[1]。沉水植物整株浸没于水中,不仅能吸收水体中的氮、磷等营养物质[2-3],还能吸附水体中的生物性和非生物性的悬浮物质,从而改善水质[4],提高水体透明度[5],增加水体溶解氧[6],有效缓解水体富营养化现象[7]。因此,沉水植物在湖泊水体生态修复中具有重要地位,特别是在维护水域生态平衡、调控水体水质、净化污染水体、防治湖泊富营养化等方面发挥着举足轻重的作用。菹草(Potamogetoncrispus)作为秋生夏衰的沉水植物,可以弥补湖库沉水植物秋冬季节性空缺,被广泛应用于富营养化湖泊生态修复中,并逐渐成为我国长江中下游湖库中秋冬季节的优势物种[8-9]。菹草衰亡期正值初夏,进入衰亡期后,较高的水温会加速植物体腐解,其残体在水体中自然腐解会对水生生态系统产生较为复杂的负面影响,其中的氮营养盐释放规律值得重点关注[1,10]。多形态氮素在水中扮演着重要角色,蛋白质和氨基酸等有机氮参与细胞生长代谢过程,腐解后多种无机氮的转化过程较为复杂[10]。因此,研究沉水植物季节性衰亡过程中氮素营养物质迁移规律以及其机理对于有效控制湖库季相交替期的营养循环具有重要意义。

沉水植物衰亡过程中,上覆水中的浮游细菌参与了植物残体分解的全过程,对沉水植物腐解过程的营养循环起着至关重要的作用[11-12]。一方面,浮游细菌可以分解有机物质,转化水体中的营养成分[13];另一方面,浮游细菌是极为敏感并易受环境影响的生物类群,上覆水环境的变化反过来会影响浮游细菌群落结构[14-16]。因此,常用上覆水中细菌的丰度和群落结构的变化来反映湖库的营养循环以及生态环境的情况,并作为评判生态修复的重要指标[17-19]。同时,研究浮游细菌群落结构及环境因子对其驱动作用,有助于加深对整个湖泊生态系统完整性的了解[20-22]。因此,研究沉水植物腐解期间上覆水的氮营养盐动态、浮游细菌群落的变化及其环境驱动因素,对于深入理解沉水植物腐解过程的作用机理和科学管理湖库沉水植物群落,具有举足轻重的意义。

本研究主要以菹草为对象,通过实验室模拟手段,研究了菹草残体腐解过程上覆水水质变化及环境因子对浮游细菌的的驱动作用,旨在研究上覆水中:(1)氮素(总氮、氨氮、硝态氮、亚硝态氮)在菹草残体腐解期间的动态规律;(2)腐解期间,浮游细菌群落的结构变化及环境因子对其的驱动作用。

1 材料与方法

1.1 实验设计及样品制备

实验使用的菹草均采集自湖北省武汉市武昌区的沙湖,菹草采集后去除干净泥沙和杂质,然后用清水漂洗干净,待表面水分自然风干后,用剪刀剪取10 cm长的小段,混合均匀后按照每袋200 g的标准,装入信封袋,放入鼓风干燥箱105℃杀青30 min,最后在80℃烘干至恒重备用。为保证细菌接种,实验用水取自沙湖,沙湖水取回后,充分混匀静置一天后备用。

表1 不同稀释比上覆水水质及其对应的地表水类别*Tab.1 Overlying water quality at different dilution ratios and its surface water categories

1.2 样品预处理与测定

1.3 细菌群落分析方法

浮游细菌检测取样时,每个实验水箱采集1 L水样,摇匀后在负压状态下,经5 μm聚碳酸酯膜过滤,过滤后的水样再负压经0.2 μm聚碳酸酯膜过滤,取过滤器上0.2 μm的膜装入经灭菌的10 mL离心管内,用于浮游细菌的高通量测序。水样经聚碳酸酯膜过滤用于浮游细菌DNA提取,DNA提取样品保存在-40℃冰箱并进行Illumina高通量测序。测定区域为采用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。测序平台的初始数据采用美吉生信云进行后续分析。测序结果使用Fastp(v.0.19.6)进行质控,使用Flash(v.1.2.11)进行序列拼接,使用Uparse(v.7.0.1090)进行OTU聚类,使用Usearch(v.7.0)进行OTU统计,使用Qiime(v.1.9.1)生成丰度表,使用RDP Classifier(v.2.11)进行序列分类注释。

1.4 数据分析与处理

使用Origin 8.0进行数据分析与处理,并绘制各项水质指标的点线图。细菌测序数据利用I-Sanger云平台完成群落结构的数据分析。聚类分析使用最大邻近距离法在基于3%的差异值水平上划分多个OTUs(operational taxonomic units,操作分类单元)[24];对OTU水平的浮游细菌群落与环境因子进行去趋势对应分析(detrended correspondence analysis,简称DCA),计算其第一排序轴的梯度范围(lengths of gradient),根据Lengths of gradient特征值选用典范对应分析(canonical correspondence analysis,简称CCA)解释环境因子对细菌群落组成的影响,并进行置换检验(permutation test);网络分析根据环境因子和细菌属水平之间的Spearman相关系数使用Gephi平台确定[25]。使用Adobe illustrate 2020修饰图像。

2 结果与讨论

2.1 腐解过程上覆水理化性质变化

腐解实验从3月3日-4月3日止,共持续30天。实验过程上覆水平均温度为16.2℃。最高和最低温分别是22.1和10.3℃,实验过程中仅在开始后7天内有小幅波动,随后7～25天内的温度变化较为平缓,在第25～30天内温度骤跌至10～11℃,直至实验结束。

图1 菹草腐解过程水的理化性质变化(A组: 未稀释组; B组: 稀释2倍组; C组: 稀释4倍组。点为均值,误差棒为标准误SE,下同)Fig.1 Water physical and chemical properties during decomposition of Potamogeton crispus(A: the undiluted group; B: the 2-fold diluted group; C: the 4-fold diluted group. Data points are mean values, error bars are standard error, the same below)

ORP是水体环境条件的一个综合性指标,其反映了水质体系中所有物质表现出来的宏观氧化还原性,帮助人们了解水体中可能存在的氧化还原物质及其存在量,了解水质状态[34-35]。ORP的变化影响着水体生化反应的进行,不同的氧化还原反应中,参与反应的细菌种类不同,当水体ORP高,表明溶解氧充足,需氧菌参与反应,水体和底泥中的有机物将会分解[36]。整个反应过程中,ORP均处于负值(图1),且与DO呈现明显的反向变化趋势,实验前7天3组的ORP都波动剧烈,在第5天出现较高值(1 mV),自第10天后电位随时间而逐步降低。腐解产生的有机物逐渐聚积,消耗大量电子受体进行厌氧呼吸,导致ORP呈现还原态[37]。随着DO的逐渐恢复,ORP出现小幅抬升,厌氧活动受到抑制。在第20～25天,C组ORP的下降速度超过了其他两组。与此同时,该阶段C组的溶解氧DO和pH值均有所上升。然而,目前尚未有研究表明三者之间存在明显负相关关系,其机制原因有待进一步研究。本实验结果表明,尽管ORP的变化与DO和pH的变化似乎相反,但它们之间的负相关性并不显著(r<-0.85,P>0.05)。

水体的电导率(Cond)与水中含有导电物质的数量和浓度有关,水体中的导电物质主要是一些电解质解离出的带电离子,还有沉积物向水体中迁移的物质等[38]。与pH类似,电导率在一定程度上反映了水体的被污染程度,沉水植物的腐解过程会释放大量有机酸和营养盐,导致水体电导率升高,且电导率随污染物浓度的升高而加大。本研究中,所有实验组的电导率变化较为一致,均先在开始实验后第5天上升至最高点(A组:396 μS/cm,B组:388 μS/cm,C组:384 μS/cm),随后保持在较高水平波动。Atkinson等[39]研究表明,水柱在缺氧还原环境下,上覆水Fe、Mn浓度增多并且释放速度较快,含硫有机物的分解和硫酸盐的还原产生大量S2-。直至第25天后急剧下降至最低点(A组:330 μS/cm,B组:327 μS/cm,C组:326 μS/cm),总体呈现一个倒U型曲线。这种波动说明,腐解在25～30天时已基本完成。

浊度(Turb)和总悬浮物(TSS)的变化规律类似,仅在实验开始时有显著的组间差异,均是从实验开始的前5天就降低至较低水平,随后一直维持在较低的水平,直至实验结束(图1)。Turb和TSS均在第5天出现较低值(0.5 NTU、9 mg/L)。其主要原因是模拟实验环境的水柱较稳定,有利于悬浮物的沉降。TSS和Turb对水体中细菌群落结构会产生显著影响,较高的TSS与Turb会显著抑制变形菌门与拟杆菌门的部分菌属[40-41],但也可有利于反硝化细菌的附着生存[42]。在湖泊中,沉水植物处于生长成熟期时的水环境Turb和TSS等都较低。当沉水植物腐解或被收割后,由于残体组织的初步分解,且缺少对水流的缓冲作用,水柱底部的沉积物会更多地卷入上覆水中,而沉积物和土壤中的微生物也会裹挟其中,进而对上覆水的浮游细菌群落结构产生扰动。

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2.2 腐解过程上覆水氮素变化

图2 菹草腐解过程氮素变化Fig.2 Nitrogen change during decomposition of Potamogeton crispus

图3 菹草腐解过程上覆水细菌OTUs数量Fig.3 OTUs for the overlying water bacteria during decomposition of Potamogeton crispus

图4 菹草腐解过程中不同处理组细菌门水平的相对丰度(A组:未稀释组;B组:稀释2倍组;C组:稀释4倍组)Fig.4 Percent of community abundance on Phylum level during decomposition of Potamogeton crispus

在富营养湖泊修复中,沉水植物季相交替期发生的腐解是水质波动的因素之一,已有研究证明,植物残体的分解会对水质造成负面影响[43-44]。植物残体分解所释放的氮素会对水体造成较大的瞬时冲击(图2),进而对氮循环进程造成扰动[45]。本研究中,菹草腐解后产生的高浓度氨氮,不仅会对部分水生动物产生毒害作用[46-47],而且会促进蓝藻的繁殖。根据植物的发育特征,菹草可归类为冷季型沉水植物,初夏逐渐衰亡腐解。结合实验结果,随着湖泊水质逐步改善,今后在季相交替期间,更有针对性地及时对以菹草为代表的沉水植物进行收割管理,可以有效预防植物分解对上覆水水质的负面影响。

2.3 腐解过程中不同处理组上覆水细菌OTUs和群落结构变化分析

OTU是系统发生学或群体遗传学研究中的分类方法,人为地将某一分类单元(品系、种、属、分组等)归为同一类。在微生物多样性分析中,根据相似度水平对所有序列进行OTU划分。通常将相似度高于97%(种水平)定义为一个OTU,即代表一个物种。

利用Venn图分析发现(图3),腐解过程中上覆水的OTU数量出现变化。第1天的OTU总数为4923个,3个组的OTUs数分别为1384、1728和1811,其中共有OTUs数为931(占比38.02%);第30天的OTU总数为3149个,3个组的OTUs数分别为1250、1088和811,其中共有OTUs数为494(占比29.20%)。腐解前后3个组的细菌OTUs总数分别下降10%、37%和55%。第1天时,3组的共有浮游细菌OTUs数量最多(931个),分别占A、B、C 3组细菌OTUs总数的67.27%、53.88%和51.41%(图3a);第30天时,共有的细菌OTUs数量减少至494个,分别占3组细菌OTUs总数的39.52%、45.40%和60.91%(图3b),第1天的共有OTUs数量占比的排序与第30天的相反(第1天:A>B>C;第30天:C>B>A)。随着腐解的进行,A组独有的OTUs占比增加,在第1天占细菌OTUs总量的7.80%,第30天时占比提升至23.88%,而B、C组在第30天的独有OTUs占比的略有下降。第1天的浮游细菌OTUs的组间差异与腐解对不同水质的影响有关,水质越好,残体腐解产生的氮素冲击越大(图2),越有利于浮游细菌的繁殖。第30天的菌群OTUs降低说明菹草残体腐解过程中,浮游细菌群落的物种数量会发生减少。根据第1天和第30天的结果对比可知,腐解期间上覆水共有细菌OTUs在组内的占比随水质的改善而提高;水质越好腐解时释放的营养物质对上覆水中的微生物群落冲击程度越大,而水质变好有利于共类细菌的生长和繁殖,此类细菌以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主[48-49]。

不同处理组上覆水细菌门水平的相对丰度分布特征见图4(保留前10种)。结果表明,主要优势细菌门(>80%)的种类基本不随营养状态和腐解进程而变化。不同水质不同时间的优势细菌门前6类种类相同,分别为变形杆菌门(Proteobacteria)、放线杆菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、类杆菌门(Bacteroidota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)。变形菌门相对丰度在3组中最大,该门内的很多微生物不仅可以通过异养获能,其很多细菌属可以从太阳光中获得能量进行代谢[50],多样化的能量途径有利于变形菌门在自然界中广泛存在。放线菌、类杆菌门、蓝藻菌门和疣微菌门是湖泊水体浮游细菌群落中的常见优势类群[51-52]。

优势细菌门的排序随水质差异发生变化,主要通过影响厚壁菌门、疣微菌门、放线杆菌门和蓝藻菌门的相对丰度大小进而影响优势菌门的排序差异(图4)。水质条件不同导致的营养盐浓度差异会对浮游细菌群落组成有较大影响。在较好水环境中,植物分解导致的营养元素升高对部分细菌分解者的数量与活性有更强的促进作用[53],但在富营养环境中,细菌的营养需求被基本满足,因此营养盐浓度的提升对其数量与活性的影响并不显著[54]。在本研究中,氮素冲击程度随水质改善而加强,厚壁菌门是参与氮循环的重要细菌[55],因此该菌门在稀释组中的相对丰度更大,相对秩次提前。然而,营养盐浓度升高也会对部分细菌产生抑制效应。放线杆菌门的相对丰度与无机氮有显著负相关关系[56],环境中无机氮含量过高会抑制该菌门的相对丰度。N、P浓度与蓝藻菌门具有耦合关系[57],氮负荷对蓝藻菌可产生营养限制[58]。这表明,氮素变化特征会影响部分优势细菌门的相对丰度大小;水质改善后,当发生植物腐解引发的氮素冲击时,浮游细菌群落结构会朝着有利于厚壁菌门占据更大相对丰度的方向变化。

在天然水体中,水生植物腐解的前期阶段包括:快速溶淋与微生物定殖。0～3天内氮素会出现短时冲击,3天后逐渐降低(图2)。腐解开始时,营养物质通过浸出、自溶等方式进入水体中[59-60]。与原始上覆水中的浮游细菌相比,这些营养物质能促进菌群的快速生长,菌群逐渐消化一部分淋溶物质。结合实验结果可知,促进过程具有针对性,且受原始水质影响,原始水质越好,营养物质对厚壁菌门的促进效果越明显,同时该菌门细菌可促进脱氮作用,实现正反馈效果,有利于上覆水水环境的稳态恢复。此外,上覆水中氮素的急剧变化会对浮游细菌结构造成极大影响。然而,不同原始水质下植物的腐解对浮游细菌结构的影响鲜有报道。结合本实验结果,菹草残体腐解的氮冲击随水质差异而变化,短期氮素释放越多,浮游细菌相对丰度遭受氮冲击后的变化越剧烈。

2.4 环境因子与浮游细菌群落的关联分析

图5 菹草腐解过程中浮游菌群和环境因子的典范对应分析(OTU水平,数据点为样品点。点标签表示组别号、平行样号和腐解时间,例如:A2-20为A组2号样品的第20天腐解。不显著的环境变量用虚线空心箭头表示,P>0.05)Fig.5 Canonical correspondence analysis on bacterioplankton community and environmental factors during decomposition of Potamogeton crispus (OTU levels, points are sample points. Point labels indicate the group, parallel sample number and decomposed time, e.g.: A2-20 is the 20th day of decomposition for sample number 2 of group A. The dotted hollow arrow indicates that this environment variable is not significant, P>0.05)

图6 菹草腐解过程中细菌属水平和环境因子的网络分析(星号表示环境因子,圆点表示细菌属,红线代表正相关,绿色代表负相关,线宽数值为|rs|,P<0.01, |rs|>0.5)Fig.6 Network analysison bacteria genus levels and environmental factors in the decay of Potamogeton crispus (Stars represent environmental factors, dots represent bacterial genera, red lines indicate positive correlation, green lines represent negative correlation, and the thickness of the line represents the absolute value of |rs|, P<0.01, |rs|>0.5)

湖泊的水体生态修复工程中,虽然人工修复群落已发展到多种植物搭配[69-70],但菹草仍是常用的冷季型植物,并且生长具有暴发性,易在富营养化水体中过量生长[71]。在春夏交替期时依旧面临腐解导致的水质波动问题,虽然持续时间较短,但本研究表明这种波动是值得关注的。波动程度会随水质的提升而逐渐剧烈,并对上覆水中的氮素循环及其相关浮游菌群产生影响。本研究表明,腐解引起的上覆水理化性质与氮素营养盐波动,在影响浮游菌群方面可能需要同等重视。为了降低腐解引发的负面影响,沉水植物大面积衰亡后的1～3天进行残体打捞收割是较为适宜的。在对沉水植物进行收割管理的同时,研究人员也应考虑到收割的程度与收割后环境因子的变化,以平衡植物残体可能造成的淤积问题[72]和收割后水质波动对浮游细菌群落结构的影响。这对水生态修复工程中后期的科学管理提出了挑战。

3 结论

1)上覆水水质好坏与菹草分解的短期氮冲击呈现明显关联,原始水质越好,短期氮冲击越强。

2)菹草腐解与浮游细菌群落变化之间存在关联,菹草分解的营养盐影响了浮游细菌的群落结构。不同原始水质的浮游菌群对短期氮冲击响应程度有明显差异。

3)变形杆菌门是整个腐解过程中的第一大优势菌群,主导腐解全过程,水质改善有利于厚壁菌门生长和繁殖,两菌门的相对丰度增加。

4)环境因子中TSS、ORP、Turb和TN是水体浮游细菌群落结构的主要驱动因子,TSS、ORP、Turb等理化指标对水体浮游菌群的影响值得关注,环境因子对细菌群落结构的影响会随腐解进程而明显变化,但其随水质改善的变化不明显。