玫瑰精油对皮肤成纤维细胞生物学功能的影响

孙赛男

广西医科大学，广西 南宁 530021

皮肤是人的身体器官中最大的器官，具有重要的屏障保护作用[1]。受到内外源性等多重因素的影响，皮肤衰老不可避免，包括角质层变薄、活性氧增高、细胞增殖和分化减少等。降低氧自由基产生、提高皮肤成纤维细胞的抗氧化能力成为延缓皮肤衰老的当选之策。玫瑰在抗氧化方面的活性被多次报道。玫瑰精油作用诸多，包括抗菌作用[2-3]、抑制氧自由基活性、调控皮肤内环境，常被应用于化妆品、食品与医药等领域[4-5]。本文研究玫瑰精油对D-gal 诱导的小鼠皮肤成纤维细胞衰老、增殖及迁移的影响，检测皮肤成纤维细胞衰老、增殖及迁移相关指标的变化。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

细胞来源：小鼠皮肤成纤维细胞取自5～7 d Balb/c 乳鼠背部皮肤，原代分离培养后获得，Balb/c乳鼠购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要工作液的制备

D-gal 溶液：配制20 g/L 升的D-gal 溶液。

玫瑰精油：用DMSO 将玫瑰精油稀释成三个浓度。

玫瑰精油浓度①：10 μL 原浓度精油加90 μLDMSO 稀释成精油浓度①。

玫瑰精油浓度②：10 μL 精油浓度①加90 μLDMSO 稀释成浓度②。

玫瑰精油浓度③：10 μL 精油浓度②加90 μLDMSO 稀释成浓度③。

1.3 实验方法

1.3.1 原代小鼠皮肤成纤维细胞分离及培养

灭菌眼科剪分离鼠背部皮肤，剪碎用I 型胶原酶消化，离心洗脱组织团块，细胞筛过滤，放置4 mL培养瓶培养。

1.3.2 细胞传代

密度达80%，PBS 清洗，胰酶消化3 min，完全培停止消化，离心重悬后移入培养瓶孵箱中培养。

1.3.3 β-gal 苷酶染色

PBS 清洗加固定液。染色工作液：X-Gal50 微、染色液A 10 μL、B 10 μL、C 930 μL，膜封孔板防蒸发，37 ℃过夜。显微镜下记录。

1.3.4 EdU-594 细胞增殖染色

加稀释的2XEdU 染色工作液（20 uM）孵育2 h。EdU 染液标记后加固定液，洗涤液清洗。通透15 min。洗涤液清洗。0.5 mLClick 工作液：430 μL Click Reaction Buffer、20 μLCuSO4、1 μLAzide 594、Click Additive Solution 50 μL 避光30 min，洗涤后加1 mL 1X Hoechst 33342 避光10 min。洗涤后，荧光显微镜下观察记录。

1.3.5 细胞划痕

细胞达80%，用200 μL 枪头垂直划线。PBS 洗漂浮细胞后无血清培养。拍照记录0 h、24 h 细胞状态。

1.3.6 统计学分析

实验结果用GraphPad8.0 统计分析制图。p＜0.05表示差异具有统计学意义（*代表p＜0.05，**代表p＜0.01），ns 表示差异无统计学意义。

2 实验结果

2.1 玫瑰精油对皮肤成纤维细胞衰老的影响

结果显示，与对照组（D-gal 组）比较，加入玫瑰精油的各组衰老染色的阳性细胞数显著减少（p＜0.001，如图1 所示）。

图1 （10×，**表示p＜0.001）

2.2 玫瑰精油对皮肤成纤维细胞增殖的影响

结果显示，与对照组相比，加入不同浓度的玫瑰精油各组增殖的细胞数显著增多（p＜0.01，如图2 所示）。

图2 （10×，**表示p＜0.01）

2.3 玫瑰精油对皮肤成纤维细胞迁移的影响

结果显示，与对照组相比，加入不同浓度的玫瑰精油各组细胞迁移的面积显著增多（p＜0.001，如图3所示）。

图3 （4×，**表示p＜0.001）

3 讨论

人们在深入认识皮肤衰老后发现，皮肤可以保护机体内组织和器官免受环境中物理、化学和生物因素的侵袭；能防止组织内营养成分、水分和电解质等物质的流失。受多重因素影响，皮肤衰老不可避免。减少自由基的产生、清除老化代谢产物和提高抗氧化酶活性已成为目前延缓皮肤衰老的有效方法。有很多研究证实玫瑰具有抗衰老和抗氧化能力。

有研究表明，自然衰老皮肤角质形成细胞增殖减少[6]。有研究证实，D-gal 致衰老与自然衰老的一致性较高，D-gal 衰老细胞模型被广泛应用于评价天然活性物质的抗衰老作用。

在D-gal 衰老模型中加入不同浓度的玫瑰精油，D-gal+玫瑰精油组衰老染色的阳性细胞数显著减少，玫瑰精油增强细胞的抗氧化能力，从而对细胞衰老有修复作用。EdU-594 细胞增殖染色实验中，D-gal+玫瑰精油组细胞增殖数明显高于衰老模型组，说明玫瑰精油可以增强细胞的增殖能力。迁移实验中，D-gal+玫瑰精油组的细胞24 h 迁移率明显高于衰老模型组，表明玫瑰精油可以增强细胞的迁移能力。

综上所述，玫瑰精油具有延缓皮肤成纤维细胞衰老、促进细胞增殖和迁移的作用。玫瑰精油的其他功效还有待进一步探究。