基于网络药理学研究银丹心脑通软胶囊调控AKT抑制血管内膜增生的作用机制

罗亚丹,丁瑞雪,鲍宇翔,吕俊远,杨丹莉

(1.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学 药学院,贵州 遵义 563099;3.遵义医科大学附属医院 普通外科,贵州 遵义 563099)

心血管疾病是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因[1],其中,冠状动脉粥样硬化疾病(coronary atherosclerosis disease,CAD)的患病率和死亡率占比较大[2]。经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)是治疗CAD的有效手段[3],但术后易发生血管内膜增生[4]。目前治疗血管内膜增生的药物有待进一步的发掘。中药复方制剂银丹心脑通软胶囊(yin dan xin nao tong soft capsule,YDXNT)减轻气滞血瘀引起的胸痹、胸闷、气短和心悸等症状,用于防治冠心病、心绞痛、高脂血症、脑动脉硬化、中风、中风后遗症等病症。YDXNT有抗血管内膜增生作用,但其作用机制尚不完全明确。本研究采用球囊损伤复制大鼠颈动脉血管内膜增生模型,结合网络药理学分析方法探讨银丹心脑通软胶囊对内膜增生的作用机制,将KEGG结果中筛选出的PI3K/AKT信号通路作为验证其治疗血管内膜增生的可能机制,明确YDXNT对血管内膜增生的治疗作用与其调控AKT相关,以期为YDXNT在PCI术后血管内膜增生领域的临床应用推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学数据库 药物相关数据库:中国知网(https://www.cnki.net/);Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/);Symmap数据库(http://www.symmap.org/);Targetnet数据库(http://targetnet.scbdd.com/);Swiss Target Prediction数据库(https://www.swisstargetprediction.ch/)。疾病相关数据库:OMIM数据库(https://omim.org/);DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/);GeneCards数据库(https://www.genecards.org/);网络药理学富集分析相关数据库:Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/);Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);STRING数据库(https://string-db.org/);Metascape数据库(https://metascape.org/)。软件:Cytoscape3.7.2;R3.6.0;微生信在线作图(http://www.bioinformatics.com.cn/);Openbable;autodock tool;autodock vina;Pymol。

1.2 实验动物与试剂

1.2.1 动物 雄性SD大鼠30只(SPF级),购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物质量合格证号:SCXK(湘)2019-0004,体质量(300±20)g。饲养于遵义医科大学SPF级动物实验中心,维持饲料喂养,自由饮食,光照循环条件12 h明/12 h暗,温度(25±2)℃,湿度(50±10)%。使用许可证号:SYXK(X)2021-0003。动物伦理委员会批准号:ZMU21-2205-036。

1.2.2 药物与试剂 银丹心脑通软胶囊由银杏叶、丹参、灯盏细辛、绞股蓝、山楂、大蒜、三七、艾片组成(贵州百灵企业集团制药股份有限公司生产,批准文号为国药准字Z20027144,产品批号为20190228)。免疫组化试剂盒(Elabscience,E-IR-R217);抗体:AKT、p-AKT(Thr308)抗体(affinity公司,AF6259、AF3262)。

1.3 方法

1.3.1 网络药理学

1.3.1.1 银丹心脑通软胶囊成分查询 在TCMSP数据库查询中药的成分,符合ADME参数OB≥30%且DL≥0.18[5]的活性物质认为是活性成分,并在中国知网数据库和PubMed数据库上通过文献检索补充不满足上述ADME参数但有明显药效作用或液相检测出的含量较高的活性成分。

1.3.1.2 银丹心脑通软胶囊活性成分靶点预测 将1.3.1.1项筛选出的活性成分导入TCMSP数据库,Symmap数据库得到活性成分的靶点。通过Pubchem数据库查询活性成分的Canonical SMILES,导入Swiss Target Prediction数据库和targetnet数据库,筛选Prob≥0.9的结果[6]。将预测的活性成分靶点导入UniProt数据库统一为标准基因名。将获取的靶点汇总去重得YDXNT的相关靶点。

1.3.1.3 内膜增生相关靶点收集 利用OMIM、DisGeNET 和GeneCards数据库对“内膜增生”(Neointimal hyperplasia)获取疾病靶点,去重后即为内膜增生的靶点。将1.3.1.2得到的YDXNT相关靶点与内膜增生的靶点通过Venny 2.1.0取交集,交集靶点即为YDXNT作用于内膜增生的潜在作用靶点,绘制韦恩图。

1.3.1.4 构建蛋白互作网络(PPI) 将1.3.1.3所得交集靶点导入STRING数据库构建PPI,在“multiple proteins”栏目输入YDXNT抗内膜增生的潜在作用靶点,设定物种为“Homo sapiens”,置信度为0.700,获取PPI,将此网络导入Cytoscape可视化,采用CytoNCA插件计算网络中节点的拓扑参数获得关键靶点。

1.3.1.5 富集分析 将1.3.1.3所得的交集靶点导入至Metascape数据库,进行GO生物过程、细胞成分、分子功能和KEGG的富集分析。物种选择“H.sapiens”,富集参数设定为“Min Overlap=3;Pvalue cutoff=0.01;Min Enrichment=1.5”。以P≤0.01且Count值从大到小排序作为筛选条件,选取符合条件的前20的KEGG,绘制GO和KEGG气泡图。Cytoscape软件构建YDXNT抗内膜增生的中药-活性成分-关键靶点-显著通路网络。

1.3.1.6 分子对接 将关键靶点及其对应的活性成分进行分子对接实验。自Pubchem数据库下载活性成分的*sdf格式文件;从PDB数据库下载蛋白3D结构*pdb格式文件。利用Openbable将*sdf格式转换*pdb格式。在autodock tool中进行去水、加氢等处理,并进行小分子与蛋白对接。每个小分子和蛋白对接大于60次,选择结合能最低且氢键数大于等于2的小分子构象保存为*pdb格式,在Pymol软件中进行可视化处理。分子对接的结果用微生信在线做热图。

1.3.1.7 免疫组织化学法检测大鼠颈动脉血管新生内膜中AKT、p-AKT表达,于100倍光镜下观察。

1.3.2 体内实验

1.3.2.1 模型制备、分组及给药 SD大鼠在术前禁食8 h后采用5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧位固定在手术台上。大鼠颈部备皮、消毒后,取颈部正中切口约1.5 cm,钝性分离皮下组织、充分显露左颈动脉,左颈外动脉的近心端和远心端用血管夹夹闭,在夹闭的中段剪一呈“V”型的小口以插入2F Fogarty球囊导管,向近心端插入直至主动脉弓后以0.15 mL生理盐水充盈球囊导管,将充盈的球囊导管回拉至颈内外动脉分叉处后收缩球囊,如此重复抽拉3次后缝合伤口。假手术组不进行球囊置入和扩张损伤,其余步骤与模型组相同。实验分组:假手术组(Sham,n=10)作为空白对照组,将颈动脉血管内膜增生模型SD大鼠随机分为模型组(Model,n=10)、YDXNT给药组(YDXNT,n=10)。造模次日YDXNT组予YDXNT混悬液1.0 g/kg灌胃,Model组和Sham组予等量双蒸水灌胃,每日1次,持续14 d。

1.3.2.2 大鼠颈动脉组织形态学观察 按照步骤1.3.2.1的方法分离并取出左颈总动脉,用预冷的PBS冲洗,取血管中部用于固定包埋。切片脱蜡后用苏木精和伊红染色,封片后于100倍光镜下观察血管组织的形态。

2 结果

2.1 YDXNT相关活性成分查询结果 检索YDXNT 中药所含成分。艾片、山楂、大蒜未筛选到OB≥30%且DL≥0.18的成分,通过文献检索这3味药的有效成分予以统计,详见表1。去除重复后得到138个YDXNT相关活性成分。

表1 YDXNT药物-成分-靶点

2.2 银丹心脑通软胶囊成分靶点预测及内膜增生相关靶点收集结果 共获得YDXNT活性成分靶点773个,血管内膜增生相关靶点654个。将YDXNT活性成分靶点与血管内膜增生相关靶点取交集,作为YDXNT干预血管内膜增生的潜在作用靶点,共181个(图 1)。

2.3 PPI网络及YDXNT干预内膜增生的关键靶点 该网络的235个靶点存在6 348条相互作用。通过参数度中心性(degree centrality, DC) 、紧密中心性(closeness centrality, CC)和中介中心性(betweenness centrality, BC) 3个参数分别筛选出前10名的基因,去重后得到13个关键靶点,分别是AKT1、TNF、IL6、GAPDH、TP53、ACTB、IL1B、INS、JUN、ALB、MAPK3、EGFR、FOS。推测 YDXNT 可能通过这些靶点治疗内膜增生,见表2。STRING数据库中录入潜在作用靶点,将PPI数据文件导入 Cytoscape 软件进行可视化分析,图2。

图1 YDXNT与内膜增生靶点韦恩图

图2 YDXNT作用内膜增生的PPI网络

表2 关键靶点拓扑参数

2.4 功能富集分析 将181个潜在作用靶点导入Metascape 数据库中进行富集分析,根据P值排序,分别取分析结果的前10名绘制GO富集分析图(图3)。KEGG富集分析取前20名绘制气泡图(图4)。KEGG富集分析发现,YDXNT与内膜增生主要与肿瘤信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路等相关。生物过程(biological process, BP)主要与激素、细胞迁移、磷酸化的调节、对肽类激素和脂多糖的反应等。细胞组成(cellular component, CC)主要涉及囊腔、膜筏、膜微区、细胞质、血小板 α 颗粒、分泌颗粒管腔、转录调控复合体等。分子功能(molecular function, MF)与调控信号受体调节活性、转录因子结合、受体配体活性、蛋白激酶活性、激酶结合、转录因子结合、磷酸转移酶活性等相关。

BP:生物学过程分析;CC:细胞组分分析;MF:生物功能分析。

图4 KEGG富集分析气泡图

2.5 中药-活性成分-靶点-显著通路网络的构建 YDXNT的中药-活性成分-靶点-显著通路网络构建见图5。YDXNT可通过槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、黄芩素(MOL002714)等多个成分作用于多个靶点和通路干预血管内膜增生。

图5 中药-活性成分-靶点-显著通路网络

2.6 分子对接 将2.5所得的度值排名前3的YDXNT活性物质与2.3所得的 PPI 网络中排名前5的靶点进行分子对接验证。结果显示,AKT1(PDB ID:1UNQ),TNF(PDB ID:2AZ5),IL6(PDB ID:5FUC),GAPDH(PDB ID:6IQ6),TP53(PDB ID:6MXY)均能与槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、黄芩素(MOL002714)结合良好(结合能均小于-5 kcal/mol),见图6。槲皮素与AKT1的TYR-38、ARG-48和ASN-54形成氢键;木犀草素与AKT1的TRP-80、GLN-59和GLU-114形成氢键;黄芩素和AKT1在GLU-91和GLU-95形成氢键,见图7。3种活性成分与AKT1的PH结构域结合。

图6 蛋白与活性成分的结合能热图

A:槲皮素;B:木犀草素;C:黄芩素。

2.7 YDXNT对球囊损伤所致血管内膜增生的影响 HE结果显示,Sham组血管管腔光滑,无增生内膜;与Sham组相比,Model组血管管腔狭窄,内膜增生明显,新生内膜面积增大(P<0.05);YDXNT组血管管腔面积增大,狭窄程度改善,内膜增生减少(P<0.05),详见图8。

A:HE染色(×100);B:新生血管内膜面积统计与 Sham比较,P<0.05; *:与 Model比较,P<0.05。

2.8 YDXNT对内膜增生颈动脉组织AKT和p-AKT蛋白表达水平的影响 免疫组化法检测AKT、p-AKT(Thr308)在各组血管新生内膜中的蛋白表达量。结果显示,Sham组几乎无AKT、p-AKT(Thr308)表达;与Sham组相比,Model组血管新生内膜中AKT、p-AKT(Thr308)阳性表达增多(P<0.05);与Model组相比,YDXNT组血管新生内膜中AKT、p-AKT(Thr308)阳性表达量明显减少(P<0.05),见图9。

A: AKT的免疫组化(×100);B: p-AKT的免疫组化(×100);C: p-AKT蛋白表达统计 n=5);#:与 Sham比较,P<0.05; *:与 Model比较,P<0.05。

3 讨论

冠状动脉疾病在PCI出现后得到有效防治,但即使在现代的药物涂层支架时代,以及使用现有防止内膜增生的药物如西罗莫司或紫杉醇的情况下,PCI术后仍易发生冠脉新内膜增生[7-8]。既往研究表明,对于PCI后的CAD患者,中药(traditional chinese medicine,TCM)和中西药联合使用可降低不良心血管事件的发生[9]。

YDXNT应用于临床多年,疗效安全确定[10]。前期研究发现,YDXNT可以改善球囊损伤所致大鼠颈动脉血管内膜增生[11]。YDXNT为复方制剂,银杏叶作为君药,通过药物中有效成分的体内代谢,其多种化学成分相互作用于多个靶点发挥多种药效。网络药理学具有整体性和系统性的特点,与中医药从整体辨证论治的原理相似,在中药的现代研究中有巨大潜力[12]。本研究结合网络药理学和体内实验探究 YDXNT干预血管内膜增生的药理机制。

网络药理学通过检索TCMSP数据库,筛选YDXNT主要活性成分并预测可能的靶点。将TCMSP和文献检索筛选出的活性成分与色谱-质谱等手段获取的YDXNT成分对比发现有重合[13-14]。由于活性成分筛选时采用了普适标准(OB≥30%,DL≥0.18),导致一些研究较多和植物中普遍存在的成分在网络分析中占据较高权重,而药材中特有的活性成分一定程度忽略,因此通过检索相关文献进行补充。取血管内膜增生疾病基因和活性成分靶点的交集作为潜在作用靶点。对潜在作用靶点进行映射做PPI网络图,并应用cytoNCA插件,筛选符合DC、CC、BC参数的靶点视作关键靶标。AKT1在关键靶标中度值位居第一,AKT1是AKT重要的亚型。AKT对细胞活性与功能有着重要影响[15-16],同其他关键靶点如VEGF、TNF-α、IL-6、TP53都可以影响血管平滑肌细胞的迁移和增殖[17]。而血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转化在血管内膜增生中起关键作用,也是主流的治疗靶点[18]。KEGG富集分析显示,YDXNT可能通过PI3K/AKT信号通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、HIF-1信号通路等发挥抗血管内膜增生的作用。综上所述,YDXNT抗血管内膜增生是多靶点-多通路协同作用的结果。

分子对接结果显示,YDXNT的主要活性成分与关键靶点具有良好的结合。主要活性成分与核心靶点AKT1的对接显示活性成分结合在AKT1的PH结构域[19],而PIP3在PH结构结合引起AKT构象变化,使AKT1的Thr308磷酸化从而引发下游反应[20]。体内实验结果显示,YDXNT可有效改善球囊损伤所致大鼠颈动脉血管内膜增生,免疫组化法发现YDXNT可下调AKT和p-AKT(Thr308)蛋白表达,YDXNT或通过影响AKT1的PH结构域发挥抗血管内膜增生作用。

本研究从多个角度对银丹心脑通软胶囊抗血管内膜增生的潜在作用靶点及分子机制进行预测,并进行验证,为后续研究提供新的探索思路,及为该药物后续的临床应用研究提供理论依据。