新型生物标志物在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的研究进展

李紫薇 曹晓红

胸腔积液(pleural effusion,PE)是由于胸膜腔内液体过度产生或重吸收机制破坏所导致的一种临床疾病[1],是呼吸科的常见病之一。PE根据病因不同通常分为恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)和良性胸腔积液(benign pleural effusion,BPE)。MPE是由起源于胸膜的恶性肿瘤或恶性肿瘤从其他位置转移到胸膜引起的,约占所有胸腔积液的15%～30%。一旦确诊为MPE,患者生活质量将严重下降,且其初始诊断后患者的总生存期仅为3-12个月[2]。因此,需要尽早、准确地鉴别良恶性胸腔积液的性质,使患者得到对症对因治疗,改善生活质量。目前强调,在胸腔积液细胞沉淀中找到恶性细胞或在胸膜活检组织中观察到恶性肿瘤的病理改变是确定MPE诊断的金标准[3]。但胸水中找瘤细胞敏感度不高,仅为57.4%,临床实践中经常对胸水多次检验后仍不能发现癌细胞。因此,生物标志物的评估可被视为 MPE诊断中客观且无创的诊断替代方案。既往已有研究表明传统生物标志物在恶性胸腔积液诊断中具有重要价值。癌胚抗原(CEA)[4]是最具代表性的生物标志物,在MPE初期即可以被检测到, 含量也相对较高;糖蛋白抗原19-9(CA19-9)是一种糖蛋白抗原, 主要从癌细胞株分离而来, 当机体发生癌变时, 会导致血清及胸腔积液中的CA19-9的水平明显上升;细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)[5]多意味着是由上皮来源的肿瘤细胞转移所致,其与肿瘤大小、淋巴结状态和疾病分期有关;在一项Meta分析中[6],分别研究了CEA、CA19-9和CYFRA 21-1对肺腺癌相关MPE的诊断准确性。其中CEA曲线下面积(area under the curve,AUC)最高,为0.93,其敏感度为0.75,特异度为0.96;CA19-9的敏感度为0.58,特异度为0.84;CYFRA 21-1的敏感度为0.70,特异度为0.88。血管内皮生长因子(VEGF)是一种糖蛋白,作为血管生成的启动子,在MPE形成中起重要作用。一项Meta分析发现依据胸腔积液VEGF浓度诊断MPE的敏感度和特异度分别为0.75和0.72[7]。不足的是,传统生物标志物的特异度虽相对较高,但是总体敏感度还不能满足当前临床诊断的要求。且值得注意的是,几乎所有的荟萃分析都强调了发表偏倚的存在,这表明这些传统生物标志物的诊断准确性可能被高估了。因此,本综述在此探讨一些胸腔积液中具有潜在诊断价值且有应用前景的新型生物标志物,为临床医生提供参考。

一、蛋白质类生物标志物

1. 钙卫蛋白(Calprotectin,S100A8/S100A9)

钙卫蛋白[8]是由中性粒细胞衍生的警卫蛋白(S100A8与S100A9蛋白)结合形成的的异二聚体蛋白,其在粪便、唾液、羊水、乳汁等体液中均有不同程度分布,与炎性反应和肿瘤免疫相关。其与炎症的关系是明确的,它来源于中性粒细胞和巨噬细胞,具有促炎作用。其中粪便钙卫蛋白已经成为一种经过验证的非侵入性生物标志物,常被用来区分肠道炎症和非炎症性疾病[9]。所以在炎性和结核性胸腔积液中钙卫蛋白水平相对偏高。其也与肿瘤免疫相关,有研究表明[10],较低水平(<20ug/mL)的钙卫蛋白似乎可以促进肿瘤细胞的增殖,而较高水平的钙卫蛋白可抑制肿瘤细胞增长,介导肿瘤细胞凋亡。一些研究报道,钙卫蛋白与不同癌症的预后有关,如前列腺癌[11]和肾癌[12]。Sánchez-Otero 等人[13]测定了156例诊断为渗出性PE(67例恶性PE和89例良性PE)患者的钙卫蛋白浓度,该研究显示,钙卫蛋白在恶性胸腔积液中显著降低,具有较高的诊断价值,其中AUC为0.963。其建立了两个截点：当截断值为545ng/mL时达到最大的准确性,其敏感度和特异度分别为97.01%和88.76%;当截断值为736.4ng/mL时可达到100%的敏感度,但这使得特异度下降至83.15%。Maribel Botana-Rial[14]等人的多变量分析实验也证实了此结论,其诊断敏感度为96%,特异度为60%,阴性和阳性的预测值分别为96%,57%,阴性和阳性的似然比分别为0.06和2.4。由此可以看出,测量胸腔积液中钙卫蛋白含量可作为MPE鉴别诊断的一种可能的无创策略,它可能是细胞学方法的一个很好的补充,在临床实践中具有潜在的应用价值。

2. 载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo-E)

Apo-E[15]是控制胆固醇运输和代谢的重要血浆脂蛋白,动脉粥样硬化和阿尔茨海默病等疾病都与Apo-E的功能异常相关。随着蛋白质组学高通量技术的发展,Apo-E的过表达已被证明与某些恶性肿瘤有关,它可以作为一种自分泌或旁分泌生长因子来影响微环境,从而有助于癌变。在人类肺癌中,癌组织中Apo-E基因表达和蛋白表达水平明显高于邻近非癌组织[16],Apo-E过表达在胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和胶质母细胞瘤中也已有报道。Tyan[17]等人利用蛋白质组学技术鉴定出Apo-E是肺腺癌患者胸腔积液中独特的蛋白之一,Apo-E在MPE相关的肺腺癌中表达频率高于肺鳞状细胞癌。而且,Apo-E过表达可能促进MPE患者的癌细胞增殖和迁移,并导致侵袭性临床过程。Wang等人发现[18],在以105ng/mL为临界值时,Apo-E诊断MPE的敏感性和特异性分别为87.5%和85.3%,AUC为0.748。不足的是,此研究中所有MPE患者均为非小细胞肺癌,Apo-E对其他病因的MPE患者是否具有类似的诊断准确性仍有待进一步研究。

3. 几丁质酶样蛋白(Chitinase-like proteins,CLPs)

CLPs在很多肺部和心血管疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病[19]和心力衰竭中起着关键作用,其中甲壳质酶蛋白(YKL-40)是研究最多的CLPs。YKL-40是一种由巨噬细胞在炎症和恶性肿瘤环境中分泌的生物标志物,它是人骨肉瘤细胞体外分泌的一种糖蛋白,该糖蛋白在快速增殖和分化的组织中高度表达[20]。其在浆液性上皮性卵巢癌及子宫内膜癌诊断中具有较高价值,且与卵巢癌、胶质母细胞瘤的不良预后有关[21-24]。Javath H.S.[25]等人对147例胸腔积液患者的YKL-40进行了评价,他们发现恶性胸腔积液中YKL-40水平明显升高,以99.76ng/mL为临界值时,YKL-40诊断恶性胸腔积液的敏感度为83%,特异度为87%。但目前利用YKL-40检测恶性胸膜积液的研究很少,对于这种标志物在恶性胸腔积液诊断中的应用还不能得出明确的结论,还需要更大样本量的进一步研究。

4. B7家族 (B7 family)

既往研究发现,B7家族经常在肿瘤相关内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中过表达,且与癌症进展密切相关。它们还在细胞入侵和迁移、血管生成和表观遗传基因调控方面加速癌症进展。其中,B7-H3与B7-H4已经被证明是各种类型癌症的诊断标志,在胰腺癌、结直肠癌的临床诊断中具有较高价值[26, 27]。Chen[28]等人研究了52个非小细胞源性MPE和47个BPE中的B7-H3值,他们的中位值分别为41.60ng/mL和31.55ng/mL。当临界值为38.41 ng/mL时,B7-H3能够最大程度区分NSLCLC来源的MPE和BPE,敏感度为67.3%,特异度为91.5%。他们还发现在区分NSCLC来源的MPE和良性胸腔积液方面B7-H3与CEA和CYFRA21-1具有同等的诊断效果,且其表达水平与淋巴结转移、肺癌分化程度、TNM分期相关。Xu[29]等人搜集了98例恶性胸腔积液肺癌患者和60例良性胸腔积液患者的胸腔积液样本,发现恶性胸腔积液组B7-H4浓度明显高于良性胸腔积液组,当B7-H4的临界值为35.8 ng/mL,其敏感度为78.6%,特异度为91.7%,准确度为83.5%,阳性预测值为93.9%,阴性预测值为72.4%。这表明B7-H3与B7-H4在恶性和非恶性胸腔积液的鉴别诊断中是一个有价值的生物标志物。但国内对此研究还比较少,需要更多大规模的前瞻性研究来证实这一发现。

二、DNA甲基化(DNA methylation)

DNA甲基化[30]是指由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应。目前DNA甲基化已逐渐被认为是肿瘤的潜在生物标志物,已有研究报道在不同的肿瘤患者的体液分泌物中可以观察到异常DNA甲基化,例如肺癌患者的痰、膀胱癌患者的尿液和结肠癌患者的粪便等[31, 32]。其中RAS相关结构域家族1A(RASSF1A)和矮小同源盒基因2(SHOX2)等基因的异常甲基化是最有希望用于癌症诊断的新型生物标志物,且已经在多种样本类型中进行了研究,包括支气管肺泡灌洗液、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。Shi等人基于FFPE样本,发现SHOX2和RASSF1A甲基化在小细胞肺癌、肺鳞癌和肺腺癌中的阳性检出率分别为100%、96.1%和82.9%[33]。而来自PE上清液的游离DNA(PE-cfDNA)被报道为一种高质量的分子检测标本,其易得且受脱落细胞数量的影响较小。Zhang[34]等人纳入104例PE患者,利用PE-cfDNA标本,通过实时PCR评估SHOX2和RASSF1A甲基化的诊断价值。他们发现MPE样品中SHOX2和RASSF1A的甲基化状态远高于良性对照,绘制ROC曲线评价SHOX2和RASSF1A DNA甲基化对PE的诊断能力,SHOX2的AUC值为0.959,RASSF1A的AUC值为0.810,两者联合分析的AUC值为0.985。基于计算的最佳截断值(ΔCt SHOX2 10.0和ΔCt RASSF1A 13.0),其联合检测诊断敏感度和特异度分别为96%和100%。由此可见,SHOX2和RASSF1A基因甲基化的联合检测可以被认为是筛选和监测恶性胸腔积液的优良方法,具有较高的敏感性和特异性。但在他们的队列中,MPE主要是腺癌衍生的,SHOX2和RASSF1A的甲基化阳性率在特定的疾病亚型中是否存在差异还需要进一步探索。

三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)

根据不同的生理条件,巨噬细胞可以极化为经典激活(M1)表型和交替激活(M2)表型。M1巨噬细胞表达的CD86、CD80、HLA-DR通过分泌促炎症因子促进T辅助细胞1型(Th1)反应,而M2巨噬细胞通过表达CD14、CD136、CD206等,促进T辅助细胞2型(Th2)反应,可促进肿瘤生长、转移和血管生成,支持肿瘤发展,通常被称为TAMs。其中CD163+CD14+TAMs及CD206+CD14+TAMs被认为是诊断肿瘤很有前景的生物标志物,在MPE诊断中具有较高的敏感性和特异性。

1. CD163+CD14+TAMs

CD163+CD14+TAMs在很多研究中已被证明是肿瘤微环境的标志,在不同类型癌症中高表达。在肺组织切片中,CD163+CD14+TAMs的数量在恶性病变中高于良性病变,并与肿瘤的组织学分级有关[35]。膀胱癌微环境中CD163+CD14+TAMs也被证明异常升高[36]。Wang[37]等人用流式细胞术检测34例MPE和26例良性胸腔积液中CD206+CD14+TAMs的百分比,以是否含有CD163+CD14+ TAMs作为标准,其鉴别良恶性胸腔积液敏感度为78.9%,特异度为100%。当他们使用3.65%为临界值时,CD163+CD14+TAMs诊断MPE的敏感度为81.2%,特异度为100%。且值得注意的是,通过检测PE中CD163+CD14+TAMs鉴别胸腔积液可比细胞学检查提前一周得到MPE诊断,其检测灵敏度优于胸水中找瘤细胞。由此可见,CD163+CD14+TAMs有可能作为MPE的免疫诊断标志物,并且比细胞学分析具有更好的检测灵敏度。

2. CD206+CD14+TAMs

已有研究表明,CD206+CD14+TAMs可作为癌症的标志,在卵巢癌、结直肠癌患者标本[38, 39]中高表达。Pei[40]等人应用流式细胞术检测34例MPE和26例良性胸腔积液中CD206+CD14+TAMs的百分比发现,MPE中CD206+CD14+TAMs百分比明显高于良性胸腔积液,当临界值为39.8%时,其诊断敏感度为88.2%,特异度为100.0%。他们的研究也有局限性,首先,此研究纳入的样本量相对较小,需要更大的种群来确认这种方法的价值。第二,该研究分析的MPE均来源于肺癌,其他恶性疾病引起的胸腔积液未被分析,所以CD206+CD14+巨噬细胞对MPE的诊断价值需要更大规模的前瞻性研究。

四、小结与展望

MPE往往代表预后不良的晚期恶性疾病,其诊断仍是临床一个具有挑战性的问题。生物标志物的评估可被视为MPE诊断中客观且无创的诊断方案,但既往研究的传统生物标志物敏感度不足,本综述在此探讨了一些具有潜在诊断价值的新型生物标志物。相对来说,新型标志物可提高MPE诊断的敏感度和特异度,但因技术和费用等原因,国内对此研究仍较少,其临床价值、可行性和准确度有待商榷,需进一步组织大样本、前瞻性、多中心研究来评价其诊断价值。