核酸提取试剂盒对饲料中牛羊源性成分检测的影响

李 泰,朱英才,骆 璐,彭 强,凌洪权,廖星杰,王 钦,张承双

(重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120)

标准NY/T 1946-2010中给出了检测饲料中牛羊源性成分的具体方法,但是在日常的检测工作中,如果仅是按照标准提示,而没有弄清实验中若干重要的节点部分,则会出现相同的检测样品,不同的结果。为了说明这一问题,本试验购买了市面上提取核酸主要的几类试剂盒A、B、C和D,D为手提试剂盒,其余三个为机提试剂盒,通过实验比对,发现机提试剂盒A和手提试剂盒D提取的DNA在后续的荧光PCR实验中有Ct值,其他两个没有,而有Ct值的,其结果也不能很好地相互印证,本研究通过平行实验的比对,发现核酸提取试剂盒是影响检测结果的主要因素。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器

Bio-Rad CFX96TMReal-Time System C1000 TouchTMThermal Cycler(Bio-Rad, USA),全自动核酸提取仪(S厂家),SmartSpecTMPlus Spectrophotometer(Bio-Rad, USA) 。

1.1.2主要试剂

核酸机提试剂盒A;核酸手提试剂盒D;羊源性成分(Ovine)核酸检测试剂盒(荧光PCR法),批号:OVIN22072901,生产日期:2022-07-29,有效期至2023-07-28,广州维伯鑫生物科技股份有限公司;牛源性成分(Bovine)核酸检测试剂盒(荧光PCR法),批号:BOVI230113011,生产日期:2023-01-13,有效期至2024-01-12,广州维伯鑫生物科技股份有限公司。

1.1.3主要材料

Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip, white, Catalog# TLS0851,BIO-RAD; Optical Flat 8-cap strips for 0.2 ml tube strips/plates, Catalog# TCS0803,BIO-RAD;Sharpie marker, USA.

1.2 方法

首先通过预试验,对4个核酸提取试剂盒进行筛选。再称取鱼粉、阴性对照(该阴性对照是以前用普通PCR检测定性的被检样品)、0.1%阳性对照和0.25%阳性对照各两份,每份50 mg,同时设置空白对照(水),随机分成两组,按照NY/T 1946-2010和核酸提取试剂盒的操作要求,用优选的机提试剂盒A和手提试剂盒D分别进行独立的核酸提取。提取的核酸再分别进行牛源性成分和羊源性成分荧光PCR法核酸检测,操作步骤和上机检测程序按照核酸检测试剂盒说明书执行。通过对检测的Ct值进行比对,了解核酸提取试剂盒的选择在检测饲料中牛羊源性成分中的重要性。

2 结果

空白对照(水)、鱼粉和阴性对照分别经核酸机提试剂盒A处理,荧光PCR检测,其牛羊源性成分Ct值均为无,0.1%阳性对照的牛羊源性成分Ct值分别为30.38和28.38,0.25%阳性对照的牛羊源性成分Ct值分别为28.03和27.04。经核酸手提试剂盒D处理的空白对照(水),其核酸经荧光PCR检测牛羊源性成分Ct值均为无,鱼粉的牛羊源性成分Ct值分别为37.00和39.67,阴性对照的牛羊源性成分Ct值分别为39.33和37.21,0.1%阳性对照的牛羊源性成分Ct值分别为22.97和21.79,0.25%阳性对照的牛羊源性成分Ct值分别为21.87和21.04,实验结果见表1。

表1 两种核酸提取试剂盒的检测情况

3 讨论

从实验结果可以看出,0.25%阳性对照经核酸手提试剂盒D处理与经核酸机提试剂盒A处理,其牛羊源性成分Ct值两者平均值相差为6;同样,0.1%阳性对照经两种提取试剂盒处理,其Ct值平均相差为7。经核酸手提试剂盒D处理的阴性对照,其牛羊源性成分Ct值的平均值为38.27,那么核酸机提试剂盒A处理的阴性对照,其牛羊源性成分Ct值的平均值就约为44.77;同样,经核酸手提试剂盒D处理的鱼粉,其牛羊源性成分Ct值的平均值为38.335,那么核酸机提试剂盒A处理的鱼粉其牛羊源性成分Ct值的平均值就约为44.835,但事实上,核酸机提试剂盒A处理的阴性对照和鱼粉,其牛羊源性成分Ct值均为无,其实这是因为Ct值44.77和44.835已经超出了试剂盒的检测范围,而进一步溯源则是因为核酸提取试剂盒不同,经核酸手提试剂盒D处理得到的核酸,其浓度和A260/A280值均高于核酸机提试剂盒A所提取核酸的指标(数据未展示)。

含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用[1],被认为是疯牛病传播的主要途径,禁止疫区含牛羊源性成分的动物源性饲料的生产、流通和使用,是预防疯牛病感染、流行的主要手段之一[2-4]。同时随着饲料工业的精细化发展,特别是部分部门和人群(如进出口贸易和儿童)对肉品质量的更高要求,就亟需严把饲料检测环节。为切实强化饲料质量安全监管,提高畜产品质量安全水平,促进畜牧业高质量发展[5],在运用荧光PCR法检测饲料中牛羊源性成分时[6-7],更应注意核酸提取试剂盒的选择。