高效液相色谱法测定发酵饲料中乳酸的含量

吴仕辉,黄芙蓉,雷 剑

(1.广州市华莱科检测技术有限公司//农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室,广东 广州 511400;2、清远海贝生物技术有限公司,广东 清远 511500)

近年来,由于玉米、豆粕等饲料原料价格上涨,饲料资源短缺的问题日益严重,同时随着禁抗令全面实施,饲料行业面临新的挑战。在这种背景下,发酵饲料由于其不仅可提升部分营养成分含量,还具有促生长、改善适口性、调节肠道pH值、提高动物对饲料的消化率、降低抗营养因子等作用[1-4],在饲料行业得到广泛应用。目前评估发酵饲料产品品质的指标主要包括益生菌及其代谢产物、粗蛋白质、酸溶蛋白、总酸和有机酸等[5]。其中乳酸又称2-羟基丙酸、α-羟基丙酸,是一种非常重要的有机酸,是评价发酵类产品发酵程度的重要指标之一。因此,准确测定发酵饲料中乳酸的含量具有十分重要的意义。目前,乳酸的检测方法主要有滴定法和高效液相色谱法[6],由于滴定法测定的是总酸的含量,而不是乳酸的含量,同时,滴定的终点以颜色来判断,误差较大[7]。有关液相色谱法检测乳酸的报道主要集中在食品和酿酒行业[8]。在饲料行业,GB/T 23877—2009《饲料酸化剂中柠檬酸、富马酸和乳酸的测定 高效液相色谱法》仅适用于酸化剂类饲料添加剂产品中乳酸含量的检测[9]。郭子好等[10-11]在GB/T 23877—2009的基础上,对色谱条件进行了优化,方法仅适用于发酵豆粕,具有一定的局限性。发酵类饲料产品由于在发酵过程中产生较多的小分子物质,基质较为复杂,对乳酸的检测干扰严重,目前适用于不同类型发酵饲料样品检测的通用型方法鲜有报道。本研究旨在建立一种准确测定发酵饲料中乳酸含量的通用型检测方法,为发酵饲料类产品的质量评估提供检测技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇,色谱纯,德国默克公司;无水乙醇和甲醇,分析纯,西陇科学股份有限公司;磷酸,色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;乳酸标准品,纯度≥99%,北京坛墨质检科技有限公司;强阴离子固相萃取柱(SAX),1 000 mg,6 mL,日照科谱诺新材料有限公司;样品1～6号分别是购买自市面上不同供应商和不同地区的发酵豆粕、发酵猪饲料、发酵畜禽饲料、玉米浆液、玉米浆粉、发酵虫沙等产品。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪,具紫外检测器,美国沃特世公司;电子分析天平,常州;超纯水机,德国默克密理博实验室纯水公司;玻璃纤维滤纸,北京中检维康生物技术有限公司;超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;涡旋混匀仪,杭州佑宁仪器有限公司;50 mL具塞离心管,无锡耐思生命科技股份有限公司;台式离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;微量移液器,德国艾本德股份公司;2 mL无菌注射器,江西洪达医疗器械集团有限公司;0.45 μm水系滤膜,上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1色谱条件

Ultimate R OAA有机酸专用色谱柱(5 μm,4.6 mm×300 mm),流动相:100% 0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=2.5),流速:1 mL/min,柱温:32℃,检测器波长:210 nm,进样量:10 μL。

1.3.2标准溶液的配制

准确称取30.0 mg乳酸标准品于10 mL容量瓶中,用0.1%磷酸溶液溶解并定容至刻度,混匀,该标准储备溶液浓度为3 mg/mL,有效期为3个月。准确量取适量标准储备溶液,用0.1%磷酸溶液稀释配制乳酸浓度分别为:1、6、30、150、300 mg/L的系列标准工作溶液。临用前现配。

1.3.3发酵饲料样品中乳酸的提取

准确称取2.00 g样品于50 mL离心管中,加入20 mL纯水,涡旋震荡5 min,在4 000 r/min下离心3 min后,将上清液转移至100 mL容量瓶中,向残渣中加入20 mL纯水重复提取1次,合并提取液于同一容量瓶中,用无水乙醇定容,混匀。

取适量样液过玻璃纤维滤纸,准确移取10.0 mL滤液于100 mL鸡心瓶中,向鸡心瓶中加入10 mL无水乙醇,在80℃±2℃下旋转浓缩至近干,再加入5 mL无水乙醇继续浓缩至干,在鸡心瓶中加入纯水多次溶解残渣,根据样品含量的不同,参照表1将样液转移至5～100 mL容量瓶中进行适当的稀释并定容。取2.5 mL稀释后的样液过经活化(使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化)的SAX固相萃取柱,再用5 mL纯水淋洗净化柱,最后用5 mL 2%磷酸甲醇溶液洗脱,收集洗脱液于50 mL鸡心瓶中,洗脱液在45℃下旋转蒸发至干后,用5 mL 0.1%磷酸溶液振荡溶解并过0.45 μm水系滤膜后,注入高效液相色谱仪分析。

表1 不同乳酸含量的样品对应不同称样量的建议

1.3.4发酵饲料中乳酸的检测

分别吸取10 μL系列标准工作溶液和样品溶液,注入液相色谱仪检测,以标准溶液质量浓度(X,mg/L)为横坐标,以对应峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,并进行回归计算得到乳酸的回归方程和相关系数,检测样品中乳酸的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

比较了3种色谱柱对样品分离效果的影响,分别为Agilent C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)、资生堂C18色谱柱(3 μm,4.6 mm×150 mm)、Ultimate R OAA有机酸专用色谱柱(5 μm,4.6 mm×300 mm)。发酵饲料样品经纯水直接提取后(参见2.2.1),采用0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5为流动相,分别选择上述3种色谱柱进行分析。图谱分别如图1、图2、图3所示。可以看出图3(有机酸专用柱)目标峰受杂质干扰程度最小,分离效果最好。因此最终选择有机酸专用柱进行样品分析。

图1 Agilent C18柱测定样品中乳酸含量的液相色谱图

图2 资生堂C18色谱柱测定样品中乳酸含量的液相色谱图

图3 有机酸专用柱测定样品中乳酸含量的液相色谱图

2.2 前处理方法的优化

2.2.1提取方法的选择

采用直接提取法:称取2.00 g发酵饲料置于100 mL容量瓶中,加60 mL水,60℃超声提取30 min,冷却至室温,用水定容至刻度摇匀,过玻璃纤维滤纸至澄清,取适量滤液过0.45 μm水系滤膜,注入高效液相色谱仪中,样品的图谱如图3所示。

采用固相萃取法:样品经纯水提取后,过SAX固相萃取柱小柱净化(参见1.3.3),取适量滤液过0.45 μm水系滤膜,注入高效液相色谱仪中,样品的图谱如图4所示。

图4 固相萃取法测定样品中乳酸含量的液相色谱图

由图3和图4可以看出,样品经固相萃取净化后,分离效果有了明显的提升,目标峰分离度较好,峰型尖锐,且杂质对目标峰无干扰,能够更准确地进行定量,所以本实验采用SAX固相萃取柱进行净化处理。

2.2.2稀释倍数对检测结果的影响

由于发酵饲料样品中乳酸含量较高且跨度范围大,为防止乳酸含量过高导致的固相萃取小柱过载问题,我们进一步验证了稀释倍数对结果的影响。取发酵豆粕样品,经纯水提取,无水乙醇定容至100 mL后,将样液分别经1.25、2.5、5、10倍稀释后过活化的固相萃取柱,并分别收集经固相萃取小柱后的样液和淋洗液上机测试,并对检测结果进行比较,如表2所示。

表2 同一样品不同稀释倍数的测定结果

由表2数据可以看出,收集的样液和淋洗液中均检测出不同含量的乳酸,且乳酸含量随着样品稀释倍数的增大而减小,说明样液中乳酸含量太高,导致过固相萃取柱时目标物过载,目标物不能全部保留在小柱上;当样品的稀释倍数为10倍时,在收集的样液和淋洗液中均未检测出乳酸,所以对于发酵豆粕样品以及含量与之相当的其他种类的样品,均要将样品至少稀释10倍以上进行实验。因此对于不同乳酸含量的发酵饲料样品,我们在实际操作过程中要根据样品情况进行适当的稀释,具体参照表2。

2.3 流动相的优化

分别采用0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5和100% 0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH=2.5)作为流动相,分别对标准溶液及样品溶液进行上机测试。对于标准溶液,两种流动相都能获得良好的分离度,其中用100% 0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH=2.5)作为流动相的标准溶液色谱图见图5。

图5 乳酸标准品的高效液相色谱图

但是对于样品溶液,可以看出,用100% 0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH=2.5)作为流动相(见图6),目标物峰型尖锐,且不受杂质干扰,明显优于0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5流动相(见图4);同时,由于无有机溶液参与,检测成本更低,更环保。

图6 流动相优化后测定样品中乳酸含量的液相色谱图

2.4 线性关系与方法检出限和定量限

精确配制1、6、30、150、300 mg/L 5个浓度梯度的乳酸标准溶液,根据前面优化好的液相方法进行上机分析,标准曲线的回归方程为:Y=2.79e+002X+7.09e+001,相关系数R2=1.000 0,表明乳酸溶液在1～300 mg/L的范围内线性关系良好。采用在空白基质中添加目标组分的方法,依据色谱峰的信噪比S/N≥3为检出限,S/N≥10为定量限,得到发酵饲料样品中乳酸的检出限为30 mg/kg,见图7,定量限为50 mg/kg,见图8。

图7 方法检出限的高效液相色谱图

图8 方法定量限的高效液相色谱图

2.5 方法重复性与回收率

选取1个发酵豆粕样品,分为6份,每份2.00 g,同时检测乳酸的含量,结果如表3所示。由表3可以看出,该方法对于检测发酵豆粕中乳酸含量的结果重复性好,批间或批内的相对标准偏差(RSD)值符合一般检测方法小于10%的要求。

表3 同一发酵豆粕6次的检测数据

选取1个发酵饲料样品,分别加入不同浓度水平的标准溶液,算得的浓度减去未加标准溶液样品中乳酸的浓度计算方法的回收率,结果如表4所示。由表4可知,加标量为456～2 299 mg/kg,回收率在86.6%～98.0%,实验结果表明该方法的回收率良好,结果准确可靠。

表4 发酵饲料加标实验的结果

2.6 方法适用性

将该方法应用于饲料行业内用量较大的产品如酒糟类、发酵棉粕、菜粕、豆粕、发酵畜禽饲料、发酵玉米、发酵玉米浆液等不同种类的12种发酵饲料中的乳酸含量测定,结果见表5。结果表明,玉米浆粉的乳酸含量最高,高脂酱油糟的乳酸含量最低。本次检测的发酵饲料样品的乳酸含量范围在0.1%～23.1%,说明由于发酵原料来源和发酵工艺的差异,不同发酵饲料产品的乳酸含量差距较大,乳酸作为发酵饲料成品的主要质量指标之一,该方法可以提供重要的乳酸检测技术支撑。

表5 不同的发酵饲料产品的乳酸含量测定数据

3 结论

本研究采用高效液相色谱和紫外检测器,用外标法定量计算,建立了发酵饲料中乳酸含量的测定方法,实验结果表明,该方法具有抗干扰能力强、灵敏度高、重复性好、准确的特点,特别适合于发酵类饲料样品中乳酸的测定。同时从不同的发酵饲料样品的乳酸检测结果来看,不同厂家的发酵工艺和程度不一样,其中乳酸含量也存在较大差异,影响发酵工艺的参数有很多,此方法的建立对乳酸用发酵饲料的生产改进和质量提升具有积极的意义和较高的参考价值。