基于不同种源的三叶青化学成分及抗氧化能力对比分析——以浙江省杭州市富阳区为例

陈喜根，孙晗靖，杨丽君，缪强，朱罗妹，蔡晓郡*

(1.杭州市富阳区富春街道区域发展与治理中心，浙江 杭州 311402；2.杭州市富阳区农业农村局，浙江 杭州 311400；3.浙江理工大学，浙江 杭州 310018；4.杭州市富阳区场口镇区域发展与治理中心，浙江 杭州 311411)

三叶青学名三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，浙江省杭州市富阳区在三叶青资源驯化选育和种植过程中，于2020—2022年对区内发现的5个三叶青种源集中至春江街道石硃坞基地开展农艺性状评价(编号为石硃1～5号)，观察总体长势旺盛表现为分枝多、密，对比区内各种源农艺性状表现出一定差异[1]，块根以灰棕色—棕色为主(3号棕褐色)；茎大都圆形，近根部茎基本为明显紫(褐)色(3号为绿色)；块根多长椭圆形或长条形(2号为短椭圆形或颗粒状)，直径或粗壮程度按大小依次为1号(1.667±0.571 cm)>3号(1.388±0.433 cm)>2号(1.172±0.400 cm)>4号(0.750±0.467 cm)>5号(0.786±0.341 cm)；块根表面大多光滑(2号有皱缩现象)，表现出不等瘤状突起(5号无瘤状突起)；1、2、3、5种源还表现出须根发达现象。为进一步了解区内各种源的活性成分，以总黄酮、总多酚、多糖含量及UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力为评价指标[2]对上述5个种源进行检测，为富阳区内三叶青种质资源分类、保存、鉴定及评价提供基础数据支撑。

1 试验与方法

1.1 原材料处理及干燥处理方式

2020—2022年在浙江省杭州市富阳区内开展农艺性状评价的5个(编号石硃1～5号)三叶青种源，栽培年份、环境均一致。取各种源新鲜三叶青块茎，流水清洗干净、沥干后，分为100 g每份，置于室内阴干，每隔3 h翻动一次，阴干150 h左右后切成1～2 mm片状；进行真空冷冻干燥处理至恒重(含水量12%左右)。干燥后样品用LG-01高速中药粉碎机研磨成粉末，过60目筛(孔径0.25 mm)，装袋密封，置干燥密闭容器中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 总多糖含量的测定

标准曲线的绘制：精密称取无水葡萄糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，吸取2 mL配制浓度为0.100 mg·mL-1的对照品溶液。量取对照品溶液，配置不同浓度，分别置10 mL具塞试管中，各加水补至1 mL，精密加入5%的苯酚溶液1 mL，摇匀，再精密加硫酸5 mL，各加水补至10 mL摇匀，在490 nm处测定吸收度，以浓度C(mg·mL-1)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.436 7C+0.066(R2=0.999 3)，结果显示，无水葡萄糖在0.02～0.12 mg·mL-1内有良好线性关系。

样品制备和总多糖含量测定：精密称取0.500 g三叶青粉于50 mL容量瓶中，加40 mL水，沸水水浴2 h，冷却定容至刻度，离心10 min(6 000 r·min-1)，精密取上清液5 mL，加入无水乙醇20 mL，4 ℃下静置过夜，离心5 min，弃上清液，沉淀用80%乙醇洗涤后，离心5 min并弃上清液，重复3次，沉淀用水溶解定容至25 mL。精密量取供试品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，显色处理，在490 nm处测定吸收度，计算三叶青多糖的含量。

1.2.2 总黄酮含量的测量

标准曲线的制备：精密称取芦丁标准品5.00 mg，加适量70%乙醇溶解，定容至200.0 μg·mL-1的标准溶液，分别吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10%AlCl3溶液0.3 mL摇匀，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀放置15 min，于500 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。得回归方程为A=6.735 2C-0.010 3(R2=0.999 4)，结果显示，芦丁在0.01～0.09 mg·mL-1内有良好线性关系。

样品制备和总黄酮含量测定：精密称取0.500 g三叶青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超声提取2次，每次超声温度为60 ℃，时间为25 min，合并提取液，离心，取上清液测定总黄酮含量。取0.1 mL样品于10 mL容量瓶中，显色处理，于500 nm处测定吸光度，计算三叶青总黄酮的含量。

1.2.3 总多酚含量的测定

标准曲线的绘制：准确称取10 mg没食子酸，加蒸馏水溶解定容至100 mL，依次吸取该溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL福林试剂，混匀，加入5 mL饱和Na2CO3溶液定容，混匀，常温避光放置显色30 min，于760 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。得回归方程为A=78.419C+0.029 8(R2=0.999 3)，结果显示，芦丁在0.01～0.07 mg·mL-1内有良好线性关系。

样品制备和多酚含量测定：精密称取0.500 g三叶青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超声提取2次，每次超声温度为60 ℃，时间为25 min，合并提取液，离心，取上清液测定总多酚含量。吸取0.1 mL于10 mL容量瓶中，显色处理，760 nm处测定吸光度值。

1.2.4 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

精密称定样品粉末0.1 g，加入5 mL 70%甲醇，精密称定，超声破碎45 min，取出，放冷，然后于10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用0.22 μm疏水PTFE滤头进行过滤，即得供试品溶液，重复5次。

安捷伦BEHC18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；0.1%甲酸水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脱(0～1 min，5%B；1～3 min，5%～10%B；3～6 min，10%～20%B；6～16 min，20%～70%B；16～20 min，70%～100%B)；设置流量为0.3 mL·min-1，仪器柱温30 ℃，200～600 nm为检测波长；供试品溶液进样量为2 μL。采用电喷雾电离；去溶剂气体：氮气；碰撞气体：氩气；全扫描：50至1 200 da，源温度：120 ℃，去溶剂温度：450 ℃，锥电压：25 V，锁定喷雾标准：400 ng·mL-1，检测供试品，所有数据均由MassLynx4.1(Waters.MA.USA)软件收集。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的测定

精密称取0.300 g三叶青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液7.5 mL，超声提取2次，每次超声温度为60 ℃，时间为25 min，合并提取液，离心，乙醇定容至30 mL。取样液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于试管中，加乙醇补齐至1 mL，阳性对照精密称取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到浓度为10 mg·mL-1的VC原溶液，稀释不同浓度，加入DPPH乙醇溶液1 mL混合均匀，避光反应90 min，517 nm下的吸光度值，记做Ai，对照以无水乙醇代替DPPH溶液，测量吸光度，记做Aj，标准组用1 mL DPPH溶液与1 mL乙醇混合均匀，记做A0，进行3次平行实验。按如下公式计算供试品的自由基清除率：

DPPH清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的测定

精密称取0.500 g三叶青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超声提取2次，每次超声温度为60 ℃，时间为25 min，合并提取液，离心，乙醇定容至50 mL。取样液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，加乙醇补齐至1 mL。阳性对照精密称取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到浓度为10 mg·mL-1的VC原溶液，稀释不同浓度，加入ABTS溶液2 mL混合均匀，避光反应90 min，734 nm下的吸光度值，记做Ai，对照以无水乙醇代替ABTS溶液，测量吸光度，记做Aj，标准组用1 mL ABTS溶液与1 mL乙醇混合均匀，记做A0，进行3次平行实验。按如下公式计算供试品的自由基清除率：

ABTS清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

2 结果与分析

2.1 区内各种源主要成分含量分析

富阳区内各三叶青种源均含有较丰富的多糖、黄酮和总酚含量，但不同种源间成分含量差异较大(表1)，发现石硃1、4、5号总多糖、总黄酮、总酚类含量明显高于石硃2、3号，由于试验在相同环境栽培下种植取样，可能各种源在各自生长环境温度、光照、土壤、水质等因素影响下，不仅外观农艺性状出现差异，在内含成分生成机制上亦出现差异，因此，在相同栽培环境条件下将对各种源具体成分差异开展进一步试验研究。

表1 富阳区不同种源三叶青内含主要成分含量测定Table 1 Determination of the content of main components in Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from different provenances in Fuyang District 单位：μg·g-1

通过甲醇提取开展细胞水平初步抗癌实验得知，富阳石硃各品种1～5号IC50值为543.3、415.2、824.5、264.1、1 679 μg·mL-1，得到的石硃1～4号回归曲线趋势较好(石硃5号数值明显超出其余各种源有待试验校正)，说明区内各三叶青种源对癌症细胞均有一定抑制作用，但本文结果仅根据实验数据初步分析，有待再次开展试验以校正研究结果。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

从图1中可以看出石硃1～5号的化学轮廓大体一致，石硃5号的成分种类表现更为丰富，石硃2、3号成分种类略偏少。

图1 石硃1～5号UPLC-Q-TOF-MS/MS的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of UPLC-Q-TOF-MS/MS for Shizhu 1-5

经过鉴定，可知只有石硃1号在保留时间为3.402时鉴定得到的化合物为vanillic acid-1-O-apiofuranosyl glucose ester，为黄酮类化合物。石硃1、4、5号保留时间为6.417时鉴定到的化合物为kaempferol-3-O-furanose-7-O-rhamnosylglucoside，为黄酮类化合物。只有石硃5号中在保留时间为7.078时鉴定得到的化合物，为isoorientin-2″-O-rhamnoside，黄酮类化合物(表2)。可知石硃1～5号富含黄酮类化合物，以石硃5号中所含的黄酮类化合物最为丰富。

表2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分鉴定结果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS component identification results

2.3 DPPH及ABTS自由基清除能力对比

结果见表3，在同一浓度(1.5 mg·mL-1)下，区内不同种源三叶青对 DPPH、ABTS自由基的清除能力大小为石硃4号>石硃5号>石硃1、2号>石硃3号。石硃4号抗氧化能力远远高于其余4个种源，DPPH自由基清除能力是石硃3号的3.05倍，ABTS自由基清除能力是石硃3号的4.63倍。

表3 富阳区不同种源三叶青自由基清除能力的测定结果Table 3 Measurement results of free radical scavenging ability of different provenances of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Fuyang District 单位：%

3 结论

黎颖菁等[2-8]对三叶青种质多样性与栽培管理研究均表明，不同产地、种质三叶青块根总黄酮含量等存在显著差异，本试验通过不同种源间三叶青中活性成分总黄酮、多糖、总多酚含量及DPPH、ABTS自由基清除能力对比，发现石硃1、4、5号总多糖、总黄酮、总酚含量明显高于石硃2、3号；但DPPH、ABTS自由基清除能力以石硃4、5号为好。试验基本证明了抗氧化性能与活性成分含量试验结果相似，可能因为抗氧化性能与样品中活性物质含量、组成和浓度有关[9]，同时不同三叶青种源内含成分存在差异亦表明遗传育种上有较大的潜力。三叶青种质遗传多样性解释了其药效成分的巨大差异[10]，作为浙江省三叶青道地产区的富阳要加强种质多样性保护，对新发现的小叶紫藤、易成型结块、块根葫芦型三叶青种源开展种质资源评价及株系选育驯化，进一步筛选出总黄酮等活性成分高、块根产量优、抗病性好的富阳特色种质资源，为三叶青种质资源分类、保存及生产品质提升提供科技支撑。