不同规格细管对冷冻猪精复苏质量的比较研究

周 健 ，刘闻一 ，付小青 ，朱 琳 ，赵云翔 ，2

（1.河南秀博科技有限公司，河南 许昌 461000；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530000）

1 前言

当前，人工授精技术在养猪行业中得到普遍使用，优秀个体间的基因交流通过猪精来实现，猪精作为基因的载体，在种猪育种和商品化生产中占据重要的地位。猪精保存方式共分为三种，常温液态保存、低温液态保存和超低温固态保存。常温液态保存的猪精行业使用率已达到90%以上，而超低温固态保存的猪精使用率只有1%左右，这主要与猪精对温度的敏感性以及冻精操作方法的复杂性等因素有关。猪精超低温固态保存通常使用细管进行，以0.25 mL和0.5 mL细管居多，小容量细管冻精在批量配种时会暴露出诸多的问题，需要多次解冻数支冻精细管来进行输精，延长输精时间的同时增加了劳动强度，使用大容量细管冷冻猪精是推广冻精配种技术的重要措施之一。本研究比较了0.5 mL和5 mL细管冻精解冻后的冷冻效果，在此基础上对解冻后精子处在38℃环境下的耐受性做进一步比较，为大容量细管冻精研究提供试验依据。

2 材料与方法

2.1 试验动物及精液收集

选取身体健壮的杜洛克公猪作为试验动物，在扬翔股份旗下公猪站收集精液样本，均使用自动采精系统采集公猪精液，精液量达到100 mL以上时作为试验样本并且检测合格后运输到扬翔育种中心北方冻精实验室进行冷冻试验。

2.2 主要试验仪器及试剂

TurboFreezerM程序冷冻仪（米尼图），HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华），EasyCoder2.0色带打印机（米尼图），KDC-2046低速冷冻离心机（安徽中科），冷冻精子平衡柜（米尼图），精子检测分析仪（IVOS-II,IMV），单头灌装机MPPUno（米尼图），SQS2精液分析仪，SQS TEST染色试剂，Leja 8 腔玻片，0.5 mL冻精细管（米尼图），5 mL冻精细管（米尼图）。甘油（Sigma），乳化剂Equex-Paste（米尼图），Androstar®CryoPlus，新鲜卵黄。

2.3 试验方法

2.3.1 精液冷冻处理

将每头公猪精液平均分成2份，经过1倍稀释后17℃梯度降温2 h，在此温度下进行900 g离心20 min，离心后弃掉精浆保留精子沉淀，添加冷却液充分混匀悬浮后置于5℃平衡柜中降温150 min，之后添加冷冻液调整精液终密度为8×109/mL，灌装成0.5 mL/支和5 mL/支细管进行程序化冷冻，冻存3 d后按照50℃水浴16 s进行解冻。

2.3.2 解冻后精子运动性检测

冻精解冻后使用解冻液进行适当稀释，取稀释后的精液2 μL加入到Leja检测玻片中，利用计算机辅助精液分析系统（computer assisted spermatozoa analysis system—CASA）（IVOS II，IMV精子分析仪）进行精子运动性能评估，主要检测参数包括精子活力（MOT，%）、前向运动精子（PM，%）、VCL（曲线速度，μm/s）、VSL（直线速度，μm/s）、VAP（平均路径速度，μm/s）。

2.3.3 解冻后顶体完整性检测

本试验采用SQS2精子分析仪（Seminal Quality System）评估解冻后精子顶体完整性（acrosomal membrane integrity, AMI），具体方法如下：1）染色。解冻后使用解冻液10倍稀释，用移液器将20 μL稀释好的精子样品放入染料试管并重复抽打，避免气泡产生，待细胞悬液变为橙红色之后，处理完成。2）涂片并检测。用移液枪吸取5 μL精子细胞悬液添加到检测玻片腔室内，并放置到SQS2精子分析仪中检测。

2.3.4 解冻后38℃恒温孵育实验

为了验证解冻后精子体外存活时间以及冻后精子对体外环境的耐受性，特进行体外38℃恒温孵育实验。具体操作如下：解冻后14倍稀释于解冻液中，样品储存在离心管内密封并38℃±0.5℃恒温水浴孵育，检测孵育后2 h内的精子运动参数（MOT、PM、VAP、VSL、VCL），检测间隔为0.5 h。

2.4 数据统计与分析

数据先使用Excel处理，再使用SAS 9.2软件进行单因素方差检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

3 试验结果与分析

3.1 解冻后精子运动性及膜完整性检测

解冻后0.5 mL组冷冻效果优于5 mL组的冷冻效果，详见表1。解冻后精子活力（MOT，%）、前向运动精子（PM，%）、平均路径速度（VAP，μm/s）、直线速度（VSL，μm/s）0.5 mL组极显著高于5 mL组（P＜0.01）； 0.5 mL组曲线速度（VCL，μm/s）、顶体完整性（AMI，%）显著高于5 mL组（P＜0.05）。

表1 解冻后精子运动参数及顶体完整性对比

3.2 38℃恒温孵育精子活力及运动指标检测

0.5 mL和5 mL冻精38℃恒温孵育后活力和运动指标呈现出相似的变化趋势，但0.5 mL组冻精在4个检测节点上的各项指标均优于5 mL组，详见表2。横向对比发现，两组在孵育1.5 h后MOT、PM、VAP、VSL、VCL均呈显著性下降趋势（P＜0.05），而孵育2 h后各项指标与1.5 h间差异不显著（P＞0.05）。纵向对比发现，在各个检测节点上，0.5 mL组MOT、PM、VAP、VSL、VCL均显著高于5 mL组（P＜0.05）。

表2 0.5 mL组和5 mL组冻精38℃恒温孵育实验

4 讨论

目前，学者们普便认为使用大容量规格的细管冷冻精液比小容量细管冷冻效果差。除冷冻保护液不同因素外，其最主要的原因是细管容量影响精液的温变速率，从而导致在冷冻和复苏过程中损伤较多的精子。

4.1 不同组冻精解冻后精子运动参数比较

本试验使用0.5 mL和5 mL细管冷冻猪精，解冻后复苏效果表现出很大不同，精子活力、前向运动精子、运动速度以及顶体完整性两组之间均有显著差异（P＜0.05）。众所周知，精液冷冻保存通常要经历精子降温、液氮冷冻，解冻复苏三个过程，温度从生理温度（35℃）降到液氮（-196℃）温度需要经历巨大的温差，在这过程中降温速率对精子冷冻效果至关重要。温度降至10℃以内时，猪精细胞极易出现冷休克，这是由猪精子特定的质膜结构决定的，猪精子膜上胆固醇与磷脂比值较低增加了其对温度的敏感性。另一方面，精液冷冻过程中需要一定的冷冻速率，保证精子内水分子通过渗透作用离开精子，防止精子内残留的水分子形成冰晶，从而减少对精子的机械损伤，0.5 mL和5 mL容量的冻精其冷冻速率有所不同，这也是造成不同冷冻效果的原因之一。有的学者认为精子冷冻过程中冰晶还会使溶液渗透压改变，造成精子渗透性损伤，渗透压不均和冰晶化状态还会使细胞质断裂，对细胞骨架和基因组相关结构产生不利的影响。

此外，解冻过程对精子复苏也十分重要，对精子在冰晶化阶段的危险温度要做好预防措施，尽可能让精子顺利通过危险温度区间，以保证精子不受损伤，不同类型的冻精解冻温度也有所差异，升温速率过快或过慢都将造成精子死亡。如颗粒型冻精多以干解冻法为主，温度一般在50～55℃解冻效果最佳，白雪等使用38℃水浴解冻0.25 mL冻精细管得到较高的精子活力，如戴建军等研究5 mL细管冻精52℃水浴解冻25 s得到了最佳的精子活力。本研究使用相同的解冻程序，0.5 mL和5 mL细管解冻时的升温速率也不尽相同，这可能也是冷冻效果差异显著的原因之一。不同类型的冻精细管相同温度下升温速率差异较大，对精子复苏过程中受到的损伤仍不可避免，适合不同类型细管的解冻程序仍需进一步来研究。众所周知，精子的运动性和顶体完整性常常用来预测家畜的生育能力，本试验中解冻后顶体完整性0.5 mL组显著高于5 mL组（P＜0.05），说明0.5 mL组冻精具有更高的受精能力。这与Kang等人的研究很相似，小容量细管的冻精具有更加突出的冷冻效果。在精子冻融过程中，冰晶、高渗透压以及ROS等均可使顶体的完整性缺失，还有可能使精子提前获能，有研究表明酪氨酸磷酸化水平显著升高是精子提前获能的主要表现，但与正常的酪氨酸磷酸化有所不同。本试验未进行冻精解冻后酪氨酸磷酸化水平检测，有待验证0.5 mL和5 mL细管冻精的获能状态。

4.2 解冻后38℃恒温孵育精子耐性对比

冻精解冻后其运动性会随着时间的延长而降低，在38℃环境下孵育不同规格的冻精，用来预测解冻后的精子在母畜体内的存活时间，由本试验可知，0.5 mL组和5 mL组孵育1.5 h时精子活力（MOT，%）、前向运动精子（PM，%）、平均路径速度（VAP，μm/s）、直线速度（VSL，μm/s）、曲线速度（VCL，μm/s）均显著性下降（P＜0.05），这说明冷冻损伤导致精子对外界的耐受性下降。有研究认为冷冻解冻过程所引起的精子膜脂质相变和聚集，质膜中脂质-脂质和脂质-蛋白间相互作用会发生改变，导致精子膜的流动性发生改变引起损伤。Anzar等人的研究结果也表明冻精解冻2 h后0.25 mL细管中精子的PM、VSL和VAP高于0.5 mL细管中的精子，说明较小规格的细管可以获得更高质量的冻精。在38℃环境下更容易受到脂质氧化损伤，处于此温度下的精子新陈代谢旺盛，活性氧的过度产生和抗氧化清除系统的失调，导致精子细胞的多层次结构组织（基因组、表观基因组、蛋白质组、脂质组）可能受到ROS的威胁，同时有毒代谢产物聚集也可加速精子死亡。

5 结论

使用本试验中特定的冷冻-解冻程序，0.5 mL细管冻精解冻后精子活力、前向运动精子、精子运动速度以及顶体完整性显著高于5 mL细管冻精；解冻后精子处于38℃环境1.5 h后其活力、前向运动精子和运动速度均出现显著性下降。综合而言，本试验条件下公猪0.5 mL细管冻精冷冻效果优于5 mL细管冻精。