高效液相色谱法测定黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷方法的建立

夏 辉,刘 旭,蒋国振,刘 萍,姬玲霞

陕西省粮食质量安全中心 (西安 710016)

黑米,禾本科稻属一年生草本植物。黑米呈黑色或黑褐色,稻粒外观长椭圆形,稻壳灰褐色。黑米原产中国,主要分布在中国西南高原地区,以云南、贵州、陕西、广东、广西较为集中。黑米以营养丰富、滋补保健而著称,李时珍《本草纲目》记载:黑米名为“梗谷奴”,有“滋阴补肾,健脾暖肝、明目活血”之作用,被誉为“补血米”“长寿米”。因其含有滋阴、益肾、补胃、等多种食疗功能,历代均被列为“贡米”[1]。

近年来,市场上出现了部分假冒黑米食品,这种黑米大多使用煤焦色素或苯胺色素等人工合成色素,由于人工合成色素稳定性比天然色素高,不易褪色,且价格低廉,常为不法商贩所青睐。人们经常食用这种染色黑米后会诱发基因突变、癌症等疾病[2]。天然的黑米花色苷主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷,而芍药素-3-O-葡萄糖苷含量会随着黑米的储藏期延长而下降[3]。花色苷在酸性溶液中显紫红色,在碱性溶液中显蓝色,而染色黑米不具备这些化学特性。因此,研究分析黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的检测方法,对于辨别真假黑米尤为重要,它可为食品市场监管执法提供可靠依据。

目前,国内尚无关于黑米等食品中花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷检测方法的国家标准,其测定方法只有部分行业标准、团体标准的报道。国内外有研究采用pH 示差法、近红外光谱法[4-6]、液质法测定花色苷含量,但pH 示差法和近红外光谱法准确度不高[7-8],液质法检测成本较高。本文采用高效液相色谱法测定黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量,所建立的方法准确、灵敏、重现性好。为确保黑米产品的质量和品质安全提供了可靠的检测方法保证。

1 材料与方法

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪,配有自动进样器、UVD检测器和CDS工作站,美国Agilent公司;AE200型电子天平,瑞士Mettler Teledo公司;Mili-Q超纯水机,美国Milipore公司。

1.2 材料与试剂

黑米、大米,超市市售;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品,含量98.8%,德斯特生物技术有限公司;甲醇,色谱纯,德国Merck公司;甲酸,色谱纯,德国Merck公司;盐酸,优级纯;超纯水。

1.3 方法

1.3.1标准储备液的配制

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷储备液(100 mg/L):取10.0 mg(精确至0.000 1 g)矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇盐酸溶液(95∶5,v/v)溶解并定容,摇匀,备用。

1.3.2标准工作溶液的配制

分别移取0.02 mL、0.05 mL、0.20 mL、0.50 mL、2.00 mL、5.00 mL、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷储备液于6个10 mL棕色容量瓶中,用甲醇盐酸溶液(95∶5,v/v)定容至刻度,制备成0.20 mg/L、0.50 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、20.00 mg/L、50.00 mg/L的标准工作溶液。

1.3.3仪器条件

色谱柱:C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,4 μm);流动相,甲醇∶0.5%甲酸水溶液(10∶90,v/v);梯度洗脱;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL;紫外检测器,紫外波长520 nm。

1.3.4标准工作曲线的绘制

将矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准工作溶液10 μL注入液相色谱仪进行分析,在520 nm波长下记录矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积为纵坐标,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷浓度为横坐标,绘制矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线。

1.3.5样品前处理

取黑米稻谷样品去除稻壳、稻谷和其他杂质,混匀后采用四分法分样,取样品20 g置于磨粉机上磨成粉末,过0.25 mm孔径的筛子后,低温冷藏备用。准确称取黑米粉样品0.50 g(精确至0.000 1 g)于15 mL具塞离心管中。加入10 mL甲醇盐酸溶液(95∶5,v/v),摇床震荡提取30 min,4 000 r/min离心10 min后,将上清提取液转移至50 mL具塞离心管中,再在样品中加入10 mL甲醇盐酸溶液(95∶5,v/v),摇床震荡提取30 min,5 000 r/min离心10 min后,将上清并入之前的提取液中,混匀后过0.45 μm有机相滤膜,待上机分析。

1.3.6样品测定

液相色谱自动进样器吸取10 μL样品测试液注入液相色谱仪,按照1.3.3的仪器条件测定,记录矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积,根据样品测试液的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积与标准曲线比较,计算出矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的浓度。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量计算公式如下:

式中:X为试样中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量,mg/kg;C为从标准曲线得到的待测液中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的浓度,μg/mL;V为总提取液体积,mL;W为样品水分含量,%;m为试样质量,g。

2 结果与讨论

2.1 线性结果

将1.3.2配制的标准工作溶液分别按液相色谱的仪器条件进样,以目标峰的峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进行线性回归分析,得到矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的回归方程(n=6)为:Y=19.896 238 1X-1.756 439 2 (R2=0.999 894)。结果表明:矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.20～50.0 μg/mL范围内线性关系较好。结果如图1所示。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线

2.2 检出限和定量限

取标准曲线最低点浓度为0.20 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准工作液,用甲醇不断稀释,当信噪比为3时,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的检出限为0.1 mg/kg。当信噪比为10时,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的检出限为0.3 mg/kg。图2为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷检出限色谱图。

图2 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷检出限色谱图

2.3 精密度

取浓度为2.0 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准工作液按液相色谱仪器条件连续进样6次,记录色谱图,比较色谱峰面积。精密度试验结果见表1,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷色谱图见图3。

表1 精密度试验结果

图3 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(2.0 μg/mL)色谱图

由表1可知,测得矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积的RSD为0.1%,结果表明,此方法精密度较好。

2.4 重复性

取不同黑米样品6份,每份样品称取2个平行样,前处理后按色谱仪器条件做重复性试验,记录色谱图,分别计算矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量,比较重复性,试验结果见表2。

表2 重复性试验结果

由表2可知,6份黑米样品的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的重复性为0.2%～1.3%,满足GB/T 32465—2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》对重复性的要求。结果表明,样品重复性较好。

2.5 加标回收率

按照黑米产品国家标准中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量要求,分别称取空白大米样品9份,分成3组,每组3分样品,每份0.5 g(精确至0.1 mg),再分别移取浓度为100 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准工作液1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL于空白样品中,每组浓度重复3次,按照前处理提取方法配成低、中、高浓度的待测样品加标液,按本试验方法测定,计算加标回收率。加标回收液相色谱图如图4～图6所示,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷加标回收率试验结果见表3。

表3 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷加标回收率试验结果

图4 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷加标量300 mg/kg液相色谱图

图5 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷加标量600 mg/kg液相色谱图

图6 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷加标量900 mg/kg液相色谱图

由表3可知,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷低、中、高浓度平均回收率分别为96.5%、98.4%、100.7%,RSD分别为0.4%、0.2%、0.3%,表明该方法回收率稳定。

3 结论

采用酸性甲醇溶液提取黑米中的花色苷,结合高效液相色谱法测定黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量是一种线性良好,准确度和精密度高,重复性和回收率较好的检测方法。该方法对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的检出限为0.1 mg/kg,定量限为0.3 mg/kg,该方法适用于黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的测定。该方法的研究,可为黑米食品花色苷检测方法国家标准、粮食行业标准的提出提供参考,也为保障市场监管部门执法,保护消费者合法权益和人们身体健康提供可靠依据。