乙型肝炎病毒基因B 型及基因C 型两种国家标准品研制

李克坚 郝晓甜 周诚

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性分布，全世界约有2.57 亿人长期携带HBV［1⁃2］。我国为肝病大国，中国疾病预防控制中心2019 年统计数据［3］显示，在乙类传染病中病毒性肝炎的报告发病率位列首位，报告死亡率位列第三，其中HBV报告发病率为71.77/10 万。HBV属嗜肝DNA 病毒科，为目前发现最小的DNA病毒，基因组全长约3.2 kb，为独特的带有部分单链区的环状双链模式，共分为A～J10 个基因型［4⁃5］，我国主要流行B、基因C型［6⁃7］。本文建立的HBV DNA 基因分型B型及C型标准品，用于试剂盒检测中，乙型肝炎病毒基因分型检测试剂的质量评价和控制。

1 材料与方法

1.1 样品

本科室库存的原从上海、甘肃、河南、湖南、湖北等地域的血液中心、浆站、生物制品公司等收集的多份血浆。

1.2 现行国际标准品

NIBSC2016 年发布的第四代世界卫生组织（World Health Organization，WHO）WHO HBV DNA 国际标准品（4th WHO International Standard for HBV DNA for NAT），NIBSC code：10/266，加0.5 mL 无菌水溶解后定量值为955 000 IU/mL，对数值为5.98 IU/mL，HBV 基因型为A 型。

1.3 主要试剂

乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR⁃荧光法）购自罗氏诊断产品（上海）有限公司的Roche Diagnostics GmbH 产品；乙型肝炎病毒测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）购自北京东南悦达公司的雅培贸易（上海）有限公司产品；HBV/HCV/HIV 核酸血筛检测试剂购自罗氏诊断产品（上海）有限公司的cobas®TaqScreen MPX Test（cobas s 201 系统）产品及上药康德乐（上海）医药有限公司代理销售的Grifols Diag⁃nostic Solutions Inc。产品，ProcleixUltrio Elite As⁃say。

1.4 HBV 基因分型标准品候选品的筛选

将所有收集到的血浆样品进行HBV 五项检测、HBV DNA 定量检测及HBV HCV HIV 核酸血筛检测，选择HBV DNA 检测结果为阳性且阳性值较高的样品作为初筛的HBV DNA 基因分型标准品候选品。

1.5 HBV 基因分型标准品候选品的测序

委托北京奥维森基因科技有限公司进行HBV DNA 全长序列测定。并将获得的全基因序列与GenBank 数据库中的HBV DNA 序列，利用DNAStar 软件包的MegAlign、Phylogenetic tree 进行基因序列比对、进化树分析比较。

1.6 HBV 基因分型标准品候选品的分装

将该候选品，离心15 min（离心半径20 cm，转速6 000 r/min），去除纤维，取上清。在P2 实验室生物安全柜中，按0.5 mL/支的分装量，用连续加样枪进行分装，保存于-80℃冰箱，备用。

1.7 协作标定

1.7.1 HBV 基因分型标定

邀请湖南圣湘生物科技有限公司、艾康生物技术（杭州）有限公司、珠海赛乐奇生物技术有限公司、宝瑞源生物技术（北京）有限公司、广州邦德盛生物科技有限公司、北京博奥晶典生物技术有限公司等六家企业，进行HBV 基因分型测定，验证标定分装后结果是否正确。

1.7.2 HBV DNA 定量标定

邀请湖南圣湘生物科技有限公司、艾康生物技术（杭州）有限公司、珠海赛乐奇生物技术有限公司、宝瑞源生物技术（北京）有限公司、广州邦德盛生物科技有限公司、罗氏诊断产品（上海）有限公司等六家企业，进行HBV DNA 定量测定的协作标定。用目前使用的第四代HBV DNA 国际标准品（WHO 批号：10/266）为标准，由协作标定企业自备HBV DNA 阴性血清/血浆作为稀释液，六家企业分别进行三次独立实验，每次实验分别将WHO 标准品及2 种候选品进行10 倍倍比稀释，稀释5～6 个浓度梯度，结果用Statistic 软件，采用双平行线法进行计算。

1.8 装量检查

按《中国药典》三部［8］，最低装量检查法中的容量法进行。

1.9 均匀性考察

在上述两种待标品分装过程中，分别随机抽取分装前、中、后的分装样品各2 支，分别进行3 次HBV DNA 定量测定，并将测定结果用SPSS 22 软件进行方差分析比较。

1.10 稳定性验证

采用反复冻融（2 次、3 次、4 次、5 次）、4℃放置（3 天、4 天、5 天、6 天、7 天）、室温放置（8 h、16 h、24 h）及37℃放置（2 h、4 h、8 h）保存，四种方式进行；每种保存方式取3 支样品，分别进行3 次HBV DNA 定量测定，结果分别取平均值与-80℃保存样品测定结果进行用SPSS 22 软件进行绝对偏差分析及方差分析比较。同时，进行了-20℃保存12 个月以后的样品测定，同样，用SPSS 22 软件进行绝对偏差分析及方差分析比较。

2 结果

2.1 HBV 基因分型标准品候选品的初筛

选择HBV DNA 检测结果为阳性且阳性值较高的11 份样品，作为初筛的HBV DNA 基因分型标准品候选品样品。

2.2 HBV 基因分型标准品候选品测序分析

筛选出编号为LKJ19011 的样品为HBV DNA基因B 型国家标准品候选品，编号为HL2013248的样品为HBV DNA 基因C型国家标准品候选品。测序结果的进化树分析见图1、2。

图1 HBV 基因B 型国家标准品候选品进化树分析Figure 1 Phylogenetic tree analysis of HBV B genotype national standard candidate

图2 HBV 基因C 型国家标准品候选品进化树分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of HBV C genotype national standard candidate

2.3 HBV 基因分型标准品候选品的协作标定

2.3.1 基因分型结果

六家企业标定结果均显示，HBV 基因B型候选品为B型；C型候选品为C型，均与序列分析结果一致。

2.3.2 HBVDNA定量协作标定结果

根据六家企业协作标定结果，确定第一代HBV 基因B型国家标准品特性量值为4.67×107IU/mL（对数值为7.59 lg IU/mL），CV值为3.6%，95%置信区间为1.37×107～7.96×107IU/mL（对数95%置信区间为7.30～7.88 lg IU/mL）；第一代HBV基因C型国家标准品特性量值为3.66×108IU/mL（对数值为8.56 IU/mL），CV值为2.9%。95% 置信区间为2.02×108～6.63×108IU/mL（对数值95%置信区间为8.31～8.82 IU/mL）。

2.4 装量测定

两种标准品分装装量均大于0.5 mL/支，符合装量要求。

2.5 均匀性考察

方差分析显示，基因B型标准品候选品P值为0.428（F值为1.140）；C型标准品候选品P值为0.420（F值为1.173），两者P值均大于0.05。说明分装均匀性好，分装的标准品支与支之间无差异。

2.6 稳定性验证

B型及C型两种候选品不同方式保存后测定结果与-80℃保存样品测定结果相比较，绝对偏差在±0.2 的范围内，方差分析P值均大于0.1。另外，-20℃保存12 个月后与-80℃保存样品两者测定数据分析，B 型P值为0.237（F值为1.934）、C 型P值为0.173（F值为2.737），P值均大于0.1。本次研制的HBV DNA 基因B型及基因C型国家标准品稳定性符合规定。

3 讨论

乙型肝炎病毒感染是我国重要的健康问题之一。诊断和预防HBV 感染的研究已经取得长足的进步，但治疗一直是难题，药物治疗仅能抑制病毒的复制而不能消灭病毒［9］。由于HBV 复制过程中HBV DNA 聚合酶缺乏校正功能，导致HBV 容易发生突变，基因序列具有高度变异性。根据基因序列差异的多少，全基因序列差异在8%以上作为基因型的划分依据，HBV 划分为A⁃J共10 种基因型。各基因型具有一定的地域分布特点，A型至J型在巴西均有发现。一般A型及D型主要流行于欧洲地区，其中广泛分布的基因型是D型，其为地中海地区及中东的优势基因型。E型主要于非洲西部［10］，F型主要流行于美国土著居民及波利尼西亚［11⁃12］。G型先出现在美国及法国，其流行地区有限，传播需要特殊途径［13］。亚洲的主要流行基因型为B型和C型，我国已发现的基因型有A、B、C、D和I型。流行最为广泛的是C型，占比达50.2%，我国北部（长江以北）以基因C型为主，南部以基因B型为主，D基因型主要分布在新疆、西藏，I基因型分布在我国广西。青海、西藏等以C/D 重组株流行较高。

根据2022 年6 月21 日在国家药品监督管理局网站上查询的数据显示，HBV 基因分型相关分子诊断试剂产品目前有15 家国产企业，无进口试剂产品。且我国现有的HBV 基因分型产品多为B、C、D分型产品。分子检测方法主要包括PCR荧光法，PCR⁃反向点杂交法，基因芯片法等三种方法。其中，占主导地位的方法为PCR荧光法及PCR⁃反向点杂交法。该HBV 基因分型标准品的研制涵盖了现有的主要方法。国家于2015 年7 月15 日已发布了《乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则》（2015 年第32 号）［14］，但至今为止各企业的产品技术要求仍使用各企业的企业参考品，只能定性检测，不能定量检测分析，没有基因分型国家标准品，也无统一的质量标准，急需研制国家HBV 基因分型定量标准品。用世界卫生组织（World Health Organization，WHO）第四代HBV DNA国际标准品（4th WHO International Stan⁃dard for HBV DNA for NAT，NIBSC code：10/266，基因型为A 型），作为定量标定标准，目前也仅有此WHO 标准品为可用于HBV DNA 定量分析。

大量的研究表明，HBV 基因型与病毒复制与清除，病毒变异，临床表现，治疗应答和预后均有一定的关系，能造成急慢性肝炎或者肝癌、肝硬化等多种肝脏疾病，不同基因型具有不同的致病性［15⁃16］。基因分型的研究为乙肝病毒变异的研究，发病机制的探讨，病情评估，治疗药物的选择和预后判定以及分子流行病学研究提供了有力工具［17］。为进一步的精准医疗提供了基础。本HBV基因分型标准品的研制，为HBV 核酸相关诊断产品提供质量保证，有利于HBV核酸产品的标准化、规范化研究。值得注意的是，本标准品要求在-20℃及以下保存，长期建议在-70℃下保存。另外，在使用及运输过程中可能会出现反复冻融或存放环境变化等情况，应尽量避免2 次以上反复冻融。本两种HBV 基因分型标准品的参考标准为：本品系用无菌方法采集人乙型肝炎病毒（HBV）阳性血浆制备而成，用于HBV DNA 基因分型（B型/C型）定量检测试剂中，线性及准确性的质量控制和评价。试验人员可根据所用试剂的检测范围，倍比稀释后使用。要求检测不得少于6 个连续浓度梯度，各实测浓度对数值与理论浓度对数值的绝对偏差应在±0.5 的范围内；同时，理论浓度对数值与实测浓度对数值的线性相关系数r≥0.980。B型特性量值为：4.67×107IU/mL（对数值为7.59 lg IU/mL）。C型特性量值为3.66×108IU/mL，对数值为8.56 IU/mL。